水中胞嘧啶氯化消毒副产物生成试验及毒性分析

张正斌，张诗圣，颜晓姝，林 涛,*

(1.江苏长江水务股份有限公司，江苏扬州 225009；2.河海大学环境学院，江苏南京 210098)

近年来，天然水体和饮用水配水系统中出现的溶解性微生物产物(SMPs)已经引起了广泛的关注[1-2]。SMPs由包括多糖、蛋白质、DNA、腐植酸等的大分子和细胞碎片组成。现阶段对该类污染的研究主要集中于考察其迁移转化机理并利用物化方法将其去除方面，然而将其作为消毒副产物前体物的研究仍有待扩充[3-4]。基于SMPs在饮用水处理工艺中去除的不彻底性，在后期的氯化消毒过程中会产生对人体有毒有害的含碳消毒副产物(C-DBPs)及含氮消毒副产物(N-DBPs)，进而影响饮用水安全性[5-7]。

细胞大分子可通过与水和环境的相互作用降解为小分子。嘧啶碱基和嘌呤碱基作为具有生物活性作用的非挥发性有机物(水中80%的有机物为非挥发性)，是DNA中重要的含氮组分，并已在原水和饮用水中被检测到[8-9]。据研究调查[10-11]，嘧啶碱基氯化产生C-DBPs和N-DBPs的平均水平高于嘌呤碱基，且遗传毒性也高于嘌呤碱基。此外，在2种嘧啶碱基(胞嘧啶和胸腺嘧啶)中，已有文献报道，胞嘧啶由于产生三氯硝基甲烷、二氯乙腈和三氯乙腈等，N-DBPs的数量更大而更具毒性[10]。尽管氯化能够高效降解胞嘧啶，但环境因素(如加氯量、pH和反应时间等)的作用对降解行为的影响尚不明确，且氯化降解胞嘧啶的毒理效应仍待评估。

本文采用氯化方式对DNA碱基中具有代表性的胞嘧啶进行氯化反应，考察了不同环境因素作用下氯代含碳及含氮消毒副产物的生成情况，衡量了多种消毒副产物造成的基因毒性和遗传毒性，为水环境中SMPs污染导致的饮用水消毒副产物的生成及去除提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试剂：胞嘧啶(Cytosine，纯度为99.0%)购自美国 Sigma-Aldrich 公司，其物化性质参数如表1所示；三氯甲烷(TCM)、卤乙酸(HAAs)、卤乙腈(HANs)、三氯硝基甲烷(TCNM)等消毒副产物标准物质购自德国Alfa-Aesar公司；甲基叔丁基醚(MTBE)为色谱纯，购自美国 Sigma-Aldrich 公司；其他化学药剂，如次氯酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、抗坏血酸、无水硫酸钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；配制溶液的超纯水采用Millipore超纯水净化系统(Millipore Milli-Q Gradient，Billerica，USA)制备。试验瓶用超纯水冲洗3次，然后在105 ℃的烘箱中干燥24 h。

表1 DNA碱基胞嘧啶的物化性质参数Tab.1 Selected Physicochemical Properties of DNA Base Cytosine

1.2 试验方法

氯化反应在100 mL棕色安培瓶中进行，胞嘧啶的初始浓度为0.050 mmol/L。试验采用10 mmol/L的磷酸二氢钾溶液、0.1 mol/L的HCl及NaOH将溶液调节至所需 pH(未做特殊说明时，pH 值为7.0)，并按照试验要求加入定量的NaClO溶液(使用前标定浓度，以Cl2计；未做特殊说明时，氯剂量为0.50 mmol/L)。将上述溶液装满100 mL棕色安培瓶，并使用带有聚四氟乙烯垫片的盖子旋紧并确保无气泡，保证反应生成后的挥发性 DBPs 均存在于水相中，将水样放置于黑暗环境下的培养箱内反应特定的时间(未做特殊说明时，反应时间为24 h)，温度控制为(25.0±0.50) ℃。反应结束后，从瓶中取出10 mL放入25 mL安培瓶中，加入抗坏血酸消耗余氯，再加入2 mL的MTBE(检测卤代乙腈试验中另加入10 g无水硫酸钠)，拧紧瓶塞，将有机相与水相混合溶液在漩涡振荡器上液液萃取振荡5 min，静置3 min分层，取上层有机相进入气相色谱仪检测消毒副产物生成情况。每组试验均进行3次。

1.3 消毒副产物检测方法

三氯甲烷(TCM)、卤乙腈(HANs)、三氯硝基甲烷(TCNM)样品分离方法采用甲基叔丁基醚(MTBE)为萃取剂进行液液萃取，并用配有对卤族有机物灵敏度较高的电子捕获检测器(ECD)的气相色谱仪(GC-7890B，Aglient，USA)检测，气相色谱分析参数条件如表2所示。卤乙酸(HAAs)的测定采用EPA552标准方法，采用MTBE做萃取剂进行液液萃取，用酸化的甲醇做酯化剂将卤乙酸进行衍生化以便于测定，并用GC-HP6890对酯化后的卤乙酸进行分析，选用 1,2-二溴丙烷做内标进行定量。消毒副产物的产率计算[12-13]如式(1)。

(1)

表2 消毒副产物气相色谱分析参数条件Tab.2 Analysis Parameters of GC for DBPs

1.4 毒性评估方法

采用式(2)和式(3)的毒性模型[14]评估胞嘧啶氯化产生消毒副产物的综合毒性，并选择碘乙酸(毒性最强的消毒副产物之一)作为TEFi计算的参考化合物[15]。消毒副产物对哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的细胞毒性和遗传毒性作用已在103种消毒副产物的体外试验中进行了系统的研究[16]。细胞毒性的EC值对应72 h暴露的LC50(semi-lethal concentration，半致死浓度)，而遗传毒性的EC值对应4 h暴露的50% Tail DNA值(单细胞凝胶电泳试验中，尾部DNA含量为50%)[16]。

TEQ=∑[Ci]×TEFi

(2)

TEFi=ECref/ECi

(3)

其中：Ci——某种消毒副产物的生成浓度，mmol/L；

TEFi——该消毒副产物相应的毒性当量因子；

TEQ——综合毒性当量浓度，mmol/L；

ECref——碘乙酸的有效毒性浓度，mol/L；

ECi——某种消毒副产物的有效毒性浓度，mol/L。

2 结果与讨论

2.1 加氯剂量对消毒副产物生成的影响

为考察消毒过程中消毒剂剂量对胞嘧啶氯化消毒副产物生成的影响，研究在不同加氯剂量下，胞嘧啶相应消毒副产物的产率变化情况。向含有0.050 mmol/L底物的溶液中分别加入0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mmol/L的自由氯，控制pH值=7.0，在黑暗(25.0±0.50)℃ 条件下反应24 h后进行测定分析，结果如图1所示。

图1 不同加氯剂量对胞嘧啶氯化过程中消毒副产物生成的影响 (a)消毒副产物浓度；(b)消毒副产物产率Fig.1 Effects of Different Chlorine Dosages on the Formation of DBPs during the Chlorination of Cytosine (a) Concentrations of DBPs; (b) Yields of DBPs

由图1可知，随着氯投加量的增加，除卤乙腈外的4种消毒副产物的产率均呈现上升趋势。当氯剂量/底物浓度的摩尔比为20时，三氯甲烷的产率(0.101%±0.004 0%)约为氯剂量/底物浓度摩尔比为1时产率(0.017%±0.002 0%)的6倍，再次证明了三氯甲烷在氯存在条件下具有较强的稳定性，且作为氯化终端产物之一的三氯甲烷产率随着加氯量的增加而增加[17-20]。二氯乙酸的产率总体上仅次于三氯甲烷，但当氯投加量达到0.50 mmol/L时，二氯乙酸的产率高于三氯甲烷的产率，这表明当氯剂量/胞嘧啶浓度的摩尔比从5增加至10时，二氯乙酸产率的升高速率大于三氯甲烷。

氯化胞嘧啶生成的含氮消毒副产物卤乙腈的产率随着加氯剂量的提高，表现出先升高后下降的趋势。当氯投加量为0.50 mmol/L时，二氯乙腈和三氯乙腈的产率分别有最大值0.049%±0.003 5%和0.024%± 0.002 0%。由于三氯乙腈是二氯乙腈的氯化生成物，其生成浓度低于二氯乙腈。二氯乙腈和三氯乙腈均具有不稳定性及自分解特性[21-23]，其生成浓度既取决于形成速率也取决于分解速率，且试验发现，不同氯浓度下卤乙腈生成和降解速率的贡献是不同的。据先前的研究报道，与低氯浓度水平相比，较高的氯投加量能够促进二氯乙腈和三氯乙腈在水中的降解[24-25]。当加氯剂量逐渐饱和甚至过量后，这种影响更加明显。但应当注意，在不同加氯剂量条件下，二氯乙腈是氯化胞嘧啶产生的含氮消毒副产物中突出的组分。

2.2 氯化时间对消毒副产物生成的影响

为考察消毒过程中反应时间对胞嘧啶氯化消毒副产物生成的影响，研究在不同氯化时间下，胞嘧啶相应消毒副产物的产率变化情况。向含有0.050 mmol/L底物的溶液中加入0.50 mmol/L的自由氯，控制pH 值=7.0，在黑暗(25.0±0.50)℃条件下分别反应1、6、12、24、48 h后进行测定分析，结果如图2所示。

图2 不同氯化时间对胞嘧啶氯化过程中消毒副产物生成的影响 (a)消毒副产物浓度；(b)消毒副产物产率Fig.2 Effects of Different Contact Time on the Formation of DBPs during the Chlorination of Cytosine (a) Concentrations of DBPs; (b) Yields of DBPs

由图2可知，随着氯化反应时间从1 h延长至48 h，三氯甲烷的生成表现出持续增长的趋势，产率从0.018 2%±0.002 0%升高至0.099 4%±0.005 0%，且1～6 h的产率增幅(0.020 5%)远大于6～12 h的产率增幅(0.008 9%)。先前的研究发现，三氯甲烷的生成速率在与氯的短时间接触内较快，然后逐渐减缓[26-28]。除三氯甲烷外，其他消毒副产物的产率均呈现先升高后降低的趋势。二氯乙酸浓度在1～24 h大于三氯甲烷，表明二氯乙酸是胞嘧啶氯化反应初期生成能力最强的消毒副产物。二氯乙酸、三氯乙酸、三氯硝基甲烷在氯化反应进行至12 h时分别有最大产率0.068 1%±0.004 0%、0.037%±0.002 0%、0.021%±0.002 5%，且48 h时溶液中已经无法检测到三氯硝基甲烷的存在。据已有文献报道，三氯硝基甲烷在氯化作用的过程中存在被逐渐消耗或转化生成其他消毒副产物的现象[29-31]，从而导致其产率随氯化时间延长呈现先增加后降低的趋势。而二氯乙腈和三氯乙腈的最高产率出现在24 h，分别为对应0.049%±0.003 5%和0.024%±0.002 0%。

在次氯酸的氧化下，胞嘧啶分子结构发生了脱氮反应，并随着时间的延长，脱氮程度加剧，而含氮消毒副产物的毒性要远大于常规含碳消毒副产物的毒性，在极低的浓度下即能够产生严重的毒理效应[32-33]。三氯乙腈和三氯硝基甲烷二者的产率总体上处于较低水平，且氯投加量在反应的初始阶段即存在过量的问题，表明在胞嘧啶的氯化过程中，这2种含氮消毒副产物的生成能力较弱。值得注意的是，二氯乙腈可被认为是胞嘧啶氯化反应中关键的含氮消毒副产物，这与之前一些前体物氯化消毒的研究结论相似[34-36]。

2.3 pH对消毒副产物生成的影响

为考察消毒过程中pH对胞嘧啶氯化消毒副产物生成的影响，研究在不同pH下，胞嘧啶相应消毒副产物的产率变化情况。向含有0.050 mmol/L底物的溶液中加入0.50 mol/L的自由氯，将反应溶液的pH值分别调节至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在黑暗(25.0±0.50)℃ 条件下分别反应24 h后进行测定分析，结果如图3所示。

图3 不同pH对胞嘧啶氯化过程中消毒副产物生成的影响 (a)消毒副产物浓度；(b)消毒副产物产率Fig.3 Effects of Different pH Value on the Formation of DBPs during the Chlorination of Cytosine(a) Concentrations of DBPs; (b) Yields of DBPs

由图3可知，随着pH值从5.0升高至9.0，三氯甲烷产率呈现稳定增长的趋势，产率增幅为0.095 3%，其他消毒副产物的产率均先增加后降低。当pH值=5.0～7.0时，二氯乙酸的生成能力要高于三氯甲烷，且pH值=6.0时的差距最明显，该条件下二氯乙酸产率约为三氯甲烷产率的2.5倍。卤乙酸和卤乙腈均在pH值=6.0时有最大产率，表明在偏酸性条件下更有利于其生成。而三氯硝基甲烷的生成浓度波动不是特别显著，最大产率出现在pH值=7.0时，说明酸性或碱性条件会抑制三氯硝基甲烷的存在。当pH值=9.0时，溶液中未能检测出三氯乙腈的存在，且此时三氯乙酸、二氯乙腈和三氯硝基甲烷的浓度也处于较低水平。

溶液的pH通常是影响消毒副产物形成和降解的重要因素。Xu等[37]研究发现，环状有机物在碱性条件下能够发生开环反应，然后与游离氯反应进而生成三氯甲烷。当pH较高时，卤乙腈由于不稳定会发生碱-自降解作用或碱-催化水解作用，从而生成更加稳定的消毒副产物，如三氯甲烷[19]。因此，三氯甲烷随 pH 升高而产率增加属于多因素的综合作用。此外，二氯乙腈的水解速率常数随pH的增大而增大[24]，符合pH值>6.0时二氯乙腈产率的下降速率随 pH 上升而增大的现象。同样亦能发现，在不同pH作用下，二氯乙腈是胞嘧啶氯化反应中关键的含氮消毒副产物。

2.4 氯化反应毒性评估

6种消毒副产物的毒性当量因子计算结果如表3所示。其中，二氯乙腈的细胞毒性当量因子最大，而3种含氮消毒副产物的遗传毒性当量因子遵循三氯硝基甲烷>三氯乙腈>二氯乙腈。图4(a)～图4(c)显示了通过加和毒性模型评估不同反应条件下(加氯剂量、氯化时间、pH)胞嘧啶氯化消毒副产物的细胞毒性和遗传毒性的结果。

由图4(a)可知，随着氯投加量的增加，细胞毒性表现出先增加后降低的趋势，最大值出现在加氯剂量/胞嘧啶浓度的摩尔比为10时，而遗传毒性持续增长，且氯投加量的饱和或过量使遗传毒性的增长逐渐减缓。氯化反应时间对毒性的影响如图4(b)所示。当反应时间从1 h延长至48 h时，细胞毒性和遗传毒性均呈现先增加后降低的变化趋势，且毒性最高值分别出现在24 h和12 h。值得注意的是，细胞毒性和遗传毒性的当量浓度水平在12 h时非常接近，但当氯化反应进行到48 h时，细胞毒性的当量浓度水平约为遗传毒性的11.5倍，亦即存在一个数量级的差异，表明氯化消毒时间能够对遗传毒性的波动产生重要影响。由图4(c)可知，随着反应溶液pH值由5.0升高至9.0，2种毒性的波动亦遵循先增加后降低的规律，且细胞毒性在pH值=6.0时有最大值，遗传毒性的最大值存在于pH值=7.0时，而pH值=9.0时同时存在最小的细胞毒性和遗传毒性当量浓度，表明偏碱性条件能有效降低胞嘧啶氯化消毒产生的细胞毒性和遗传毒性。

综合2.1～2.3节中不同反应条件下胞嘧啶氯化消毒副产物产率变化规律的研究结果，可以发现：增大加氯剂量可明显促进含碳消毒副产物的生成，但加氯量对毒性变化的影响受含氮消毒副产物产率的主导；随着氯化时间的延长，除三氯甲烷外的消毒副产物产率均呈先升高后降低的趋势，而毒性变化也呈现类似趋势；相比于加氯剂量和反应时间，pH的变化能同时对消毒副产物生成和毒性作用产生显著的直接影响。值得注意的是，虽然含氮消毒副产物的生成量小于含碳消毒副产物，但由于其具有更高毒性而能够主导整体的毒性当量浓度的变化。除此之外，卤乙腈的产率对细胞毒性的贡献最大，而影响遗传毒性的最关键因素是三氯硝基甲烷的产率。

图4 不同反应条件下胞嘧啶氯化产物的细胞毒性和遗传毒性 (a)加氯剂量；(b)氯化时间；(c) pH值Fig.4 Cytotoxicity and Genotoxicity of Cytosine′s Chlorinated Products under Different Reaction Conditions(a) Chlorine Dosages; (b) Reaction Time; (c) pH Value

表3 消毒副产物毒性当量因子Tab.3 Toxic Equivalency Factor of DBPs

3 结论

本研究考察了不同反应条件下胞嘧啶氯化产生的消毒副产物及其毒性情况。胞嘧啶氯化消毒能够生成三氯甲烷、卤乙酸、卤乙腈、三氯硝基甲烷等多种氯代含碳及含氮消毒副产物。二氯乙酸是胞嘧啶氯化初期生成能力最强的消毒副产物，而二氯乙腈可被认为是反应中关键的含氮消毒副产物。提高氯投加量可促进二氯乙腈和三氯乙腈在水中的降解，进而降低产率。随着加氯剂量的增加，细胞毒性先增加后降低，而遗传毒性稳定增长。随着氯化反应时间的延长，除三氯甲烷外的消毒副产物产率均表现出先升高后下降的趋势，且总体的细胞毒性和遗传毒性也遵循先增加后降低的变化。三氯甲烷的产率随 pH 的升高而增加，偏酸性条件能够促进卤乙酸和卤乙腈的产率，而中性条件有利于三氯硝基甲烷的生成。胞嘧啶氯化消毒产生的细胞毒性和遗传毒性能同时在偏碱性条件下被抑制。细胞毒性被卤乙腈的产率所主导，而影响遗传毒性的最关键因素是三氯硝基甲烷的产率。通过不同环境因素作用下胞嘧啶的氯化，探究DBPs的产生规律，评估综合毒性，为控制饮用水处理和输配过程中由于SMPs污染导致的DBPs的生成提供理论支撑，降低其对饮用水卫生安全性的威胁。