有氧运动对APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织线粒体氧化磷酸化功能的影响

房国梁 崔凯茵 赵杰修 李良 李茜

国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）是一种常发于老年人的神经系统退行性疾病，其主要临床特征为进行性认知功能障碍和记忆衰退[1]。目前对AD的致病原因学者们还没有形成统一的认识，但研究发现β-淀粉样蛋白沉积[2]、微管相关蛋白Tau异常磷酸化[3]、氧化应激损伤[4]、钙平衡失调[5]等都会对AD 的发生、发展产生重要影响。近些年来研究发现，AD的病理过程与线粒体功能障碍密切相关[6]。

线粒体是一种广泛分布于真核细胞中的细胞器，其主要功能是参与能量代谢，产生ATP，同时还参与多项细胞内重要生理功能[7]。线粒体对于维持神经元正常生理功能具有十分重要的意义[8]。但在AD患者脑中常伴有线粒体功能障碍，表现为线粒体呼吸作用和活性降低[9]以及线粒体形态学改变等[10]，这些改变都严重影响了线粒体氧化磷酸化功能。

大量研究表明，体育运动尤其是有氧运动能够延缓大脑认知功能衰退，提高大脑学习和记忆功能，对于防治阿尔茨海默症具有积极作用[11-14]。另外，研究发现有氧运动能够提高骨骼肌和心肌细胞线粒体氧化磷酸化功能，提高ATP 含量和呼吸链复合体酶的活性等[15]。但目前国内外关于有氧运动对大脑组织线粒体氧化磷酸化功能影响的研究还非常少。因此，本研究以APP/PS1 转基因小鼠和C57BL/6J 小鼠为研究模型，观察8周有氧运动后小鼠大脑皮质和海马组织中ATP含量、线粒体呼吸链复合体酶的活性、线粒体膜电位以及线粒体氧化磷酸化调控关键蛋白表达的变化情况，以揭示有氧运动对大脑组织线粒体氧化磷酸化功能的影响，为阐明有氧运动延缓AD 发生提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物饲养及分组

以AD 模型动物APP/PS1 转基因小鼠和野生型C57BL/6J 小鼠为研究对象。8月龄雄性APP/PS1 小鼠20 只，体重29.32 ± 2.76 g，每笼2 只。8月龄雄性C57BL/6J 小鼠20 只，体重32.48 ± 3.54 g，每笼5 只。自由进食饮水，光照比为12 h︰12 h，温度（20 ±2）℃，相对湿度40%～60%。在适应性饲养1 周后，APP/PS1 小鼠随机分为安静对照组（T-CG 组，n=10）和运动组（T-EG组，n=10）。C57BL/6J小鼠也随机分为安静对照组（W-CG 组，n=10）和运动组（W-EG 组，n=10）。所有研究过程和技术手段已通过国家体育总局体育科学研究所动物实验伦理委员会审查。

1.2 训练方案

所有小鼠先进行5 天的跑台适应性训练，每天训练10 min，速度9 m/min。休息2天后，T-EG 和W-EG组小鼠进行为期8周的正式训练。通过动物气体代谢分析系统测定小鼠VO2max，使小鼠训练强度维持在75% VO2max，在8周时间内跑台速度从12 m/min增至15 m/min。训练时间从30 min增至60 min，跑台坡度为0o。每周一至周五训练，周六、日休息。T-CG和WCG组小鼠则一直处于安静状态。

1.3 Morris水迷宫测试

在第9 周采用Morris 水迷宫检测各组小鼠定位航行和空间探索行为能力，判断各组小鼠学习记忆和空间记忆的认知能力。具体方法参加文献[16]。

1.4 组织分离

Morris水迷宫实验结束后，所有小鼠用10%水合氯醛溶液腹腔麻醉，然后断头取脑，在冰上迅速分离同侧相同部位大脑皮质和两侧海马组织。

1.5 ATP含量测定

切取相同大小组织块，称重后用冰预冷的PBS 溶液清洗并切成小块，随后转入冰预冷的玻璃匀浆器中。加入10 倍组织块体积且含有蛋白酶抑制剂的裂解液，在冰浴环境中进行充分匀浆，12000×g，4℃离心5分钟，取上清。将ATP 标准溶液用裂解液稀释成0.01 μmol /L、0.03 μmol /L、0.1 μmol /L、0.3 μmol /L、1 μmol /L、3 μmol /L 和10 μmol /L。按1︰100 的比例稀释ATP 检测试剂，配置成ATP 检测工作液。96 孔板每孔内加入100 μL ATP 检测工作液，室温放置 5 min。然后每孔内加入20 μL样品或标准品溶液，迅速用移液器混匀，然后用酶标仪测定RLU 值。根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度。ATP检测试剂盒购自Beyotime公司。

1.6 线粒体分离

切取相同大小组织块，称重后用冰预冷的PBS 溶液清洗并切成小块，随后转入冰预冷的玻璃匀浆器中。加入10 倍组织块体积且含有蛋白酶抑制剂的线粒体分离液，在冰浴环境中匀浆10 次左右。600 ×g，4℃离心5 min，取上清；然后11000 ×g，4℃离心10 min，弃上清，沉淀即为分离得到的线粒体。组织线粒体分离试剂盒购自Beyotime公司。

1.7 线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ相对酶活性检测

向分离得到的线粒体沉淀中加入40 μL线粒体储存液，重悬线粒体。采用BCA 法测定线粒体蛋白浓度（BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Beyotime公司）。严格按照试剂盒说明书操作，采用分光光度法检测各组小鼠大脑皮质及海马组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ酶活性，然后计算相对酶活性。线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ活性检测试剂盒均购自GENMED公司。

1.8 线粒体膜电位检测

JC-1 染色工作液用JC-1 染色缓冲液稀释5 倍，取90 μL 稀释后的JC-1 染色工作液，加入10 μL 总蛋白量为1 μg 分离的线粒体，混匀后用酶标仪进行检测。激发光490 nm，发射光530 nm，检测JC-1 单体，产生绿色荧光；激发光525 nm，发射光590 nm，检测JC-1聚合物，产生红色荧光。线粒体膜电位用红/绿荧光强度比值来表示。线粒体膜电位检测试剂盒购自Beyotime公司。

1.9 Western blot实验

向分离得到的线粒体沉淀中加入200 μL 含有蛋白酶抑制剂的线粒体裂解液，用移液器充分混匀以裂解线粒体。采用BCA 法测定线粒体蛋白浓度，使各组样品上样总蛋白量保持一致。加入5×蛋白上样缓冲液，放入100℃水浴锅中进行蛋白变性，持续10 min。然后进行SDS-PAGE 电泳，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h，然后将膜与稀释好的一抗4℃孵育过夜（实验中用到的一抗细胞色素C 氧化酶亚基5a（Cox5a）、细胞色素C 氧化酶亚基2（Cox2）和琥珀酸脱氢酶亚基C（Sdhc）抗体购自abcam公司；NADH 脱氢酶亚基1（Nd1）抗体购自proteintech公司；β-actin 抗体购自Beyotime 公司）。次日用TBST溶液洗膜5 min×3，洗去残留一抗，然后将膜与稀释好的二抗室温孵育1 h（实验中用到的二抗HRP 标记山羊抗兔IgG 和HRP 标记山羊抗小鼠IgG 购自Beyotime公司），然后用TBST 溶液洗膜5 min×4，以洗去残留的二抗。最后使用ECL化学发光试剂和X光片检测蛋白信号。

1.10 数据统计

使用Image J软件进行Western blot条带的灰度分析，应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。文中所有统计数据为3次独立实验结果的平均值±标准差，显著性检验选择双尾t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 有氧运动对小鼠学习记忆和空间记忆的影响

Morris 水迷宫实验结果显示，8 周有氧运动后WCG、W-EG、T-CG 和T-EG 组小鼠逃逸时间分别为31.27 ± 3.87 s、24.17 ± 2.33 s、49.95 ± 4.52 s 和38.10 ± 4.36 s（图1A）；逃逸距离分别为612.2 ±85.6 cm、467.1 ± 68.9 cm、926.4 ± 110.2 cm 和692.3 ± 102.7 cm（图1B）。从图1可以发现，与W-CG组相比，T-CG组逃逸时间和逃逸距离均极显著性增加（P＜0.01）。而经8 周有氧运动后，T-EG 组逃逸时间和逃逸距离与T-CG组相比均显著减少（P＜0.05）。

2.2 有氧运动对小鼠大脑皮质和海马组织ATP含量的影响

如图2 所示，W-CG 组小鼠大脑皮质和海马组织ATP 含量分别为1.61 ± 0.20 nmol/mg 和0.86 ± 0.10 nmol/mg。而T-CG组小鼠大脑皮质和海马组织ATP含量分别为1.07 ± 0.14 nmol/mg 和0.41 ± 0.09 nmol/mg，与W-CG组相比均极显著性下降（P＜0.01）。经过8周跑台训练后，W-EG 组小鼠大脑皮质和海马组织ATP 含量分别为2.14 ± 0.22 nmol/mg 和1.12 ± 0.12 nmol/mg，与W-CG组相比均显著上升（P＜0.05）。T-EG组小鼠大脑皮质和海马组织ATP 含量分别为1.33 ±0.07 nmol/mg 和0.60 ± 0.06 nmol/mg，与T-CG 组相比均显著上升（P＜0.05）。

图1 Morris水迷宫测试结果

图2 大脑皮质和海马组织线粒体ATP含量

2.3 有氧运动对小鼠大脑皮质和海马组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ酶活性的影响

如图3A所示，与W-CG组相比，T-CG组小鼠其大脑皮质线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ相对酶活性显著下降，分别为W-CG组水平的61.50% ± 5.34%（P＜0.01）、67.81% ± 6.03%（P＜0.05）、56.70% ± 5.34%（P＜0.01）、63.42% ± 7.25%（P＜0.05）和68.70% ± 5.05%（P＜0.01）。经过8周跑台训练后，与W-CG组相比，WEG 组小鼠大脑皮质线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ相对酶活性显著上升，分别为W-CG 组水平的129.27% ±7.59%（P＜0.05）、120.33% ± 7.64%（P＜0.05）、131.80%± 7.19%（P＜0.05）、130.13% ± 7.41%（P＜0.05）和135.53% ± 10.44%（P＜0.05）。与T-CG 组相比，T-EG组小鼠大脑皮质线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ相对酶活性显著上升，分别为W-CG 组水平的76.96% ±5.41%（P＜0.05）、78.48% ± 4.58%（P＜0.05）、80.39%± 5.49%（P＜0.05）和93.11% ± 5.85%（P＜0.05）；复合体Ⅱ相对酶活性有所上升，为W-CG 组水平的80.39%± 5.49%，但与T-CG组相比未达到显著性差异。

如图3B所示，与W-CG组相比，T-CG组小鼠海马组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ相对酶活性均极显著下降，分别为W-CG 组水平的57.30% ± 5.61%、61.20% ± 5.30%、64.92% ± 5.32%、55.41% ± 5.74%和68.20% ± 4.40%（P＜0.01）。经过8 周跑台训练后，与W-CG 组相比，W-EG 组小鼠海马组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ相对酶活性均显著上升，分别为WCG 组水平的131.27% ± 13.72%、126.00% ± 13.74%、132.63% ± 12.92%、134.37% ± 8.18%和142.90% ±7.37%（P＜0.05）。与T-CG组相比，T-EG组小鼠海马组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ相对酶活性均显著上升，分别为W-CG组水平的73.31% ± 3.78%（P＜0.05）、75.07% ± 4.10%（P＜0.05）、88.24% ± 3.96%（P＜0.01）、72.59% ± 5.41%（P＜0.05）和99.73% ± 6.24%（P＜0.01）。

图3 大脑皮质和海马组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ相对酶活性

2.4 有氧运动对小鼠大脑皮质和海马组织线粒体膜电位的影响

如图4所示，W-CG组小鼠大脑皮质和海马组织线粒体膜电位分别为1.02 ± 0.09 和0.63 ± 0.05。而TCG 组小鼠大脑皮质和海马组织线粒体膜电位分别为0.57 ± 0.06 和0.37 ± 0.05，与W-CG 组相比均极显著性下降（P＜0.01）。经过8周跑台训练后，W-EG组小鼠大脑皮质和海马组织线粒体膜电位分别为1.21 ± 0.07和0.79 ± 0.06，与W-CG 组相比均显著性上升（P＜0.05）。而T-EG组小鼠大脑皮质和海马组织线粒体膜电位分别为0.75 ± 0.08 和0.49 ± 0.04，与T-CG 组相比均显著性上升（P＜0.05）。

图4 大脑皮质和海马组织线粒体膜电位

2.4 有氧运动对小鼠大脑皮质和海马组织线粒体氧化磷酸化调控关键蛋白表达的影响

本实验结果显示，与W-CG 组相比，T-CG 组小鼠大脑皮质和海马组织线粒体内Cox5a、Cox2、Nd1 和Sdhc 的蛋白水平均显著下降（图5A）；其中T-CG 组大脑皮质线粒体Cox5a、Cox2、Nd1 和Sdhc 的蛋白表达水平约为W-CG 组 水平的68.72% ± 4.33%（P＜0.01）、61.23% ± 6.64%（P＜0.01）、62.41% ± 6.00%（P＜0.01）和53.70% ± 6.66%（P＜0.01）（图5B）；海马组织线粒体Cox5a、Cox2、Nd1 和Sdhc 的蛋白表达水平约为W-CG组水平的61.0% ± 9.97%（P＜0.01）、58.40% ± 6.34%（P＜0.01）、63.49% ± 6.11%（P＜0.05）和52.11% ±6.46%（P＜0.01）（图5C）。

而经过8 周跑台训练后，与W-CG 组相比，W-EG组小鼠大脑皮质和海马组织线粒体内Cox5a、Cox2、Nd1和Sdhc 的蛋白水平均显著上升（图5A）；其中W-EG组大脑皮质线粒体Cox5a、Cox2、Nd1和Sdhc的蛋白表达水平约为W-CG 组水平的156.78% ± 12.47%（P＜0.01）、143.55% ± 14.01%（P＜0.05）、167.48% ± 13.62%（P＜0.05）和174.36% ± 20.45%（P＜0.01）（图5B）；海马组织线粒体Cox5a、Cox2、Nd1 和Sdhc 的蛋白表达水平约为CG 组水平的143.22% ± 10.34%（P＜0.01）、152.68% ±15.23%（P＜0.01）、138.97% ± 14.36%（P＜0.05）和156.99% ± 12.86%（P＜0.01）（图5C）。

与T-CG 组相比，T-EG 组小鼠大脑皮质和海马组织线粒体内Cox5a、Cox2、Nd1 和Sdhc 的蛋白水平均显著上升（图5A），其中T-EG 组大脑皮质线粒体Cox5a、Cox2、Nd1 和Sdhc 的蛋白表达水平约为W-CG 组水平的99.65% ± 8.11%（P＜0.01）、80.53% ± 6.13%（P＜0.05）、88.63% ± 6.21%（P＜0.01）和87.49% ± 8.15%（P＜0.01）（图5B）；海马组织线粒体Cox5a、Cox2、Nd1和Sdhc 的蛋白表达水平约为W-CG 组水平的94.83% ±7.41%（P＜0.01）、82.12% ± 7.04%（P＜0.01）、96.73%± 9.49%（P＜0.01）和89.81% ± 8.51%（P＜0.01）（图5C）。

图5 大脑皮质和海马组织线粒体氧化磷酸化调控关键蛋白表达水平

3 讨论

线粒体是细胞合成ATP 的重要细胞器，同时也参与氨基酸、脂质和类固醇的代谢、Ca2+稳态、自由基产生、细胞氧化还原电位维持、细胞周期调节、细胞凋亡调控以及突触可塑性等多种细胞功能[17]。大脑作为能量需求和消耗最多的器官，其神经元细胞中线粒体数量也多于其他组织、器官细胞。由于神经元细胞糖酵解能力低，因此对线粒体产生的ATP 高度依赖[18]。另外，线粒体在神经元中分布并不均衡，主要集中于神经元的某些区域，如突触，这些区域ATP产生和消耗的量都非常大[19]。在神经冲动传递过程中，当一个递质被突触释放时，突触后膜上的几个离子通道被打开，允许离子流入，这需要消耗大量ATP[17]。此外，神经元其他生理活动也一并消耗ATP，以恢复离子梯度和轴突运输的动作电位。一项成像研究发现，静止的皮质神经元每秒消耗高达47 亿个ATP 分子[20]。因此，线粒体功能稳定对神经元存活和大脑正常功能维持具有十分重要的意义。

越来越多的研究表明，线粒体功能障碍是AD 发生、发展的重要病理原因，而线粒体氧化磷酸化功能下降是其主要方面[21]。质子和电子通过在线粒体呼吸链上的传递完成ATP 的合成。呼吸链由位于线粒体内膜的五种蛋白脂质酶复合体组成，包括复合体Ⅰ（NADH-辅酶Q 还原酶）、复合体Ⅱ（琥珀酸-辅酶Q 还原酶）、复合体Ⅲ（辅酶Q-细胞色素C还原酶）、复合体Ⅳ（细胞色素C氧化酶）和复合体Ⅴ（ATP合成酶）。呼吸链复合体酶活性的下降，会引起呼吸链电子传递功能的下降，从而影响细胞ATP 合成能力。已有研究显示，AD患者大脑皮质中线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ的活性均显著低于正常人，其中复合体Ⅱ下降35%～50%，复合体Ⅳ下降10%[22]。本实验也发现，与野生型C57BL/6J 小鼠相比，APP/PS1 小鼠大脑皮质和海马组织ATP 含量、线粒体呼吸链复合体酶活性和线粒体膜电位均显著下降。

有氧运动作为一种延缓AD的有效手段，能够改善脑组织线粒体氧化磷酸化功能。4 周的跑台训练能够降低由链脲霉素导致的大鼠海马组织线粒体功能障碍，增强细胞色素C氧化酶活性和ATP含量[23]。同时有氧运动可改善老年大鼠海马组织线粒体形态、结构和功能。Luo 等[24]研究发现，10 周游泳训练后18月龄SD大鼠海马组织氧化应激水平下降，神经元细胞中线粒体形态结构得到改善，并且线粒体呼吸链复合体Ⅰ和Ⅳ酶的活性增强。本研究结果显示，经过8 周的有氧运动后，C57BL/6J 小鼠和APP/PS1 小鼠大脑皮质和海马组织ATP 含量显著提高，并且线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅴ的酶活性均有所升高。说明长期的有氧运动能够增强脑组织线粒体呼吸链复合体酶活性，提高线粒体氧化磷酸化的水平，从而提高ATP 的合成能力。另外，线粒体膜电位高低能够整体反映线粒体功能是否正常。本研究结果显示，经过8周有氧运动后，C57BL/6J小鼠和APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织线粒体膜电位均显著上升，说明长期有氧运动后脑组织线粒体整体功能的提高。

对于有氧运动提高C57BL/6J小鼠和APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织线粒体氧化磷酸化功能的原因，我们进行了深入研究。Cox5a和Cox2是组成细胞色素C 氧化酶的重要亚基。而细胞色素C 氧化酶是线粒体呼吸链复合体Ⅳ，能够将细胞色素C 上的电子传递给O2生成H2O，同时将质子跨膜转运至线粒体膜间隙形成质子电化学势能差，ATP 合酶利用势能差将ADP 转化为ATP[25]。Nd1 是组成NADH 脱氢酶的一个重要亚基。NADH 脱氢酶又称为NADH-辅酶Q 还原酶，是线粒体呼吸链复合体Ⅰ，该酶的作用是先将NADH 上的两个高势能电子传递给黄素单核苷酸辅基，然后转移到铁硫聚簇上，最后将电子传递给辅酶Q[26]。Sdhc作为琥珀酸脱氢酶四个亚基之一，帮助将琥珀酸脱氢酶固定在线粒体内膜上。琥珀酸脱氢酶作为线粒体呼吸链复合体Ⅱ中的关键酶，连接氧化磷酸化与电子传递两个过程，在氧化琥珀酸的同时传递电子。因此，Cox5a、Cox2、Nd1 和Sdhc 对于线粒体呼吸链装配与功能至关重要，Cox5a、Cox2、Nd1和Sdhc表达正常与否能显著影响整条呼吸链的功能状态以及ATP生成。本研究结果显示，经过8周的跑台训练后，运动组小鼠大脑皮质和海马组织线粒体内Cox5a、Cox2、Nd1 和Sdhc 的蛋白水平与对照组相比均显著上升，说明长期的有氧运动能够显著提高大脑皮质和海马组织线粒体氧化磷酸化调控关键蛋白的表达，从而提高大脑皮质和海马组织线粒体氧化磷酸化功能。而Morris 水迷宫实验结果表明有氧运动能够提高小鼠学习记忆和空间记忆能力，从而提高认知功能。

4 结论

有氧运动能够显著提高APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织ATP 含量、线粒体呼吸链复合体酶活性和线粒体膜电位，通过提高线粒体氧化磷酸化调控关键蛋白表达，改善APP/PS1 小鼠大脑皮质和海马组织线粒体氧化磷酸化功能，提高认知功能。