响应面优化核桃分心木多酚超声辅助提取工艺

2020-12-18刘静黄慧福刘继华叶朋飞

食品研究与开发 2020年23期

刘静，黄慧福，刘继华，叶朋飞

（1.曲靖职业技术学院，云南曲靖655011；2.曲靖师范学院，云南曲靖655011）

核桃，又名胡桃、羌桃，隶属于胡桃科，与腰果、扁桃、榛子齐名，并称为世界“四大干果”，主要分布在我国云南、陕西、新疆等地，是一种具有很高经济效益和社会效益的珍贵果木[1-4]。云南自然条件优越，为核桃生长提供了优厚的地理条件，其中90%以上的县种植核桃，种植面积、产量均居中国首位。

核桃分心木，简称分心木，别名隔心木，为胡桃科植物胡桃果核内的木质隔膜[5-7]。木质隔膜呈薄片状、多弯曲、破碎而不整齐，表面呈淡棕色至棕褐色，或棕黑色，略有光泽，质脆、易折断、气微、味微苦，以块大、质薄、色黄为佳。分心木为核桃主要副产物之一，约占核桃总质量的4%～5%[8-9]，可入药，具有利尿清热、健脾固肾等功效。研究表明，分心木富含多酚[10]、多糖[11]、黄酮[12]等生物活性成分，可用于化妆品、药品等中。植物多酚又名植物单宁，为植物体内的复杂酚类次生代谢物，具有多元酚结构，具有天然性和光谱抑菌性[13-15]，在食品、药品、化妆品等行业具有广阔的应用前景。目前对植物多酚的研究较多，但对核桃分心木多酚的研究较少，因此该领域极具研究价值。超声波法是提取天然产物活性成分的一种有效手段，具有耗时短、成本低、且较传统提取方法产量高等优点[16-17]。本试验以核桃分心木为材料，探究料液比、乙醇体积分数、超声时间、超声温度对多酚提取率的影响，旨在为分心木的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

核桃：保山市蒲缥镇；没食子酸标准品（纯度≥98%）：天津市光复精细化工研究所；石油醚（分析纯）、无水乙醇（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：北京试剂有限公司；福林酚：北京索莱宝科技有限公司。

UV5100型可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；SB-3200DT超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；TDL5A离心机：上海安亭科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分心木多酚提取工艺

分心木干燥后，用粉碎机粉碎，过60目筛，待用。准确称取1.000 0 g分心木粉末，按照一定的料液比加入不同浓度的乙醇，在一定温度下的超声波清洗器中提取一定的时间。提取结束后，减压抽滤，收集滤液，采用Folin-Ciocateu[18-19]法测定提取液中多酚的含量。

1.2.2 多酚得率的计算

1.2.2.1 标准曲线的建立

精确配制1 mg/mL的没食子酸标准品母液，依次配制质量浓度为 0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/mL 的没食子酸标准溶液。精密吸取不同浓度的没食子酸标准品溶液1 mL，置于10 mL的试管中，加入0.1 mg/mL福林酚试剂5 mL，充分振摇，静置2 min，再加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，置于阴暗处静置反应60 min，以蒸馏水做空白对照，于760 nm波长处测其吸光度[20-21]。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算标准曲线方程。

1.2.2.2 多酚提取率的计算

式中：C为提取液中多酚的质量浓度，mg/mL；V1为样品提取液定容总体积，mL；V2为量取提取液样品测定定容的体积，mL；V3为测定用样液体积，mL；M为样品质量，g。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 料液比对提取率的影响

准确称取1.000 0 g分心木粉末，固定乙醇体积分数为60%、超声温度为60℃、超声时间为40 min，选取料液比为 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1∶60、1∶70（g/mL）。考察料液比对分心木多酚提取率的影响。

1.2.3.2 乙醇体积分数对提取率的影响

准确称取1.000 0 g分心木粉末，固定料液比为1 ∶60（g/mL）、超声温度为 60℃、超声时间为 40 min，选取乙醇体积分数为40%、50%、60%、70%、80%。考察乙醇体积分数对分心木多酚提取率的影响。

1.2.3.3 超声时间对提取率的影响

准确称取1.000 0 g分心木粉末，固定料液比为1∶60（g/mL）、乙醇体积分数为50%、超声温度为60 ℃，选取超声时间为 20、30、40、50、60 min。考察超声时间对分心木多酚提取率的影响。

1.2.3.4 超声温度对提取率的影响

准确称取1.000 0 g分心木粉末，固定料液比为1∶60（g/mL）、乙醇体积分数为50%、超声时间为50 min，选取超声温度为 40、50、60、70、80 ℃。考察超声温度对分心木多酚提取率的影响。

1.2.4 响应面试验

在单因素试验的基础上，以分心木多酚提取率为响应值，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选取料液比（A）、乙醇体积分数（B）、超声时间（C）、超声温度（D）为自变量，对核桃分心木多酚的提取工艺进行优化[22-23]，如表1所示。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 Factors and levels table of response surface design

1.3 数据处理

所有数据均平行做3次，结果取算术平均值。运用统计软件Origin8.5、Design Expert8.0进行数据的处理和分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的确定

根据测定的没食子酸标准品溶液在各个浓度下的吸光度值，计算得回归方程为：y=0.009 5x+0.011 7，R2=0.999 2，线性关系良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 最佳料液比的确定

料液比对多酚提取率的影响见图1。

图1 料液比对多酚提取率的影响Fig.1 The effect of material liquid ratio on extraction rate of polyphenols

由图1可知，多酚提取率随着料液比的减小呈上升的趋势，这是因为随着溶剂的增加多酚的溶解度增加。当料液比为1∶60（g/mL）时，提取率达到最高，随后下降，分析原因可能是溶剂过多，非多酚物质溶出导致提取率下降[24]。考虑成本等因素，确定料液比为1 ∶60（g/mL）最优。

2.2.2 最佳乙醇体积分数的确定

乙醇体积分数对多酚提取率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对多酚提取率的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols

由图2可知，随着乙醇体积分数增加，多酚提取呈现先升高后下降的趋势，在乙醇体积分数为50%时，多酚得率达到最大。造成这种现象的原因可能是：乙醇体积分数太高时，分心木提取液中的醇溶性杂质会溶出，影响多酚在乙醇溶液中的溶解，所以综上所述，选择乙醇体积分数为50%最优。

2.2.3 最佳超声时间的确定

超声时间对多酚提取率的影响见图3。

图3 超声时间对多酚提取率的影响Fig.3 The effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols

从图3可知，随着提取时间延长，多酚提取率呈现先升高后下降的趋势，当提取时间为50 min的时候，多酚提取率达到最大。分析可能有以下原因[25]：一是分心木细胞结构被破坏，胞内的其他成分溶出；二是提取时间过长导致多酚的机构被破坏。因此超声提取时间选择50 min。

2.2.4 最佳超声温度的确定

超声温度对多酚提取率的影响见图4。

图4 超声温度对多酚提取率的影响Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on extraction rate of polyphenols

由图4可知，随着超声提取温度的升高，提取率逐渐提高，当超声提取温度为70℃时，多酚提取率最高，随后下降，可能是由于温度过高，多酚的结构被破坏。所以超声温度选择为70℃。

2.3 响应面试验结果及分析

2.3.1 响应面试验结果

以核桃分心木多酚提取率（Y）为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，选择料液比（A）、乙醇体积分数（B）、超声时间（C）、超声温度（D）为影响因素得出试验结果如表2。

表2 响应面试验结果Table 2 The results of response surface test

对表2中的各组数据进行多项拟合回归分析，得拟合方程为：Y＝6.99+0.18A-0.096B+0.067C+0.27D+0.052AB-0.014AC+0.012AD+0.084BC+0.18BD-6.625×10-3CD-0.26A2-0.30B2-0.42C2-0.77D2。

2.3.2 方差分析

以A、B、C、D为自变量，以分心木多酚提取率Y为响应变化值，运用Design-Expert8.0对试验结果进行方差分析，方差分析结果如表3所示。

从表3可知，模型的P值达到了极显著水平；失拟项P＝0.1171>0.05，不显著，说明模型拟合度较好。决定系数R2adj为0.989 1，说明该模型能解释98.91%响应值的变化，因此可用该模型来分析和预测分心木中多酚的提取。根据F值的大小得出各因素对响应值影响顺序为：D>A>B>C。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.3.3 各因素间交互作用分析

通过Design Expert8.0软件可以做出响应面曲线图，分析超声提取温度、料液比、超声提取时间、乙醇体积分数4个因素的交互作用对分心木多酚提取率的影响，结果见图5～图10。

图5 料液比和乙醇体积分数的响应曲面和等高线Fig.5 The response surface and contour figure about material liquid ratio and ethanol concentration

图6 料液比和超声时间的响应曲面和等高线Fig.6 The response surface and contour figure about material liquid ratio and ultrasonic time

图7 料液比和超声温度的响应曲面和等高线Fig.7 The response surface and contour figure about material liquid ratio and ultrasonic temperature

图8 乙醇体积分数和超声时间的响应曲面和等高线Fig.8 The response surface and contour figure about ethanol concentration and ultrasonic time

图9 乙醇体积分数和超声温度的响应曲面和等高线Fig.9 The response surface and contour figure about ethanol concentration and ultrasonic temperature

图10 超声时间和超声温度的响应曲面和等高线Fig.10 The response surface and contour figure about ultrasonic time and ultrasonic temperature

从响应面3D图的坡度陡峭程度和等高线椭圆形状可以看出四因素之间交互作用的强弱，响应面3D图的坡度越平缓，说明因素对响应值的影响不大，相反，响应面3D图的坡度越陡峭，说明素对响应值的影响较大；等高线呈圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆则与之相反。

从图5～图10可知料液比与乙醇体积分数、乙醇体积分数与超声时间、乙醇体积分数与超声温度的等高线趋于椭圆，说明它们之间的交互作用明显；料液比与超声时间、料液比与超声温度、超声时间与超声温度的等高线趋于圆形，说明它们之间的交互作用不明显。

2.4 最佳工艺及验证试验

根据响应面回归模型方程分析，得出最优提取条件为：料液比1∶61.74（g/mL）、乙醇体积分数49.65%、超声时间50.34 min、超声温度70.83℃、提取率为7.04%。根据实际情况，将提取条件修正为：料液比1 ∶62（g/mL）、乙醇体积分数 50%、超声时间 50 min、超声温度71℃，并进行3次试验，结果取平均值为6.98%，实际所测的平均值和预测值相差-0.01%，表明试验结果与模型符合较好，可靠性较高。