百菌清对克氏原螯虾幼虾的急性毒性及安全性评价

刘开放， 杨治国， 林 伟＊

（信阳农林学院 水产学院， 河南信阳464000）

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）又称小龙虾，是我国一种重要的淡水经济虾类，克氏原螯虾味道鲜美，营养丰富[1-3]，深受消费者的喜欢，但是野生的产量，远远不能满足市场上的需求[4，5]。随着现代化养殖和生态养殖的推动，稻虾综合种养模式成为最主要的养殖模式，该模式下养殖的小龙虾产量约占全国总产量的60%以上[6，7]。稻虾综合种养能达到“一水两用，一田双收”，但是，稻田发生病虫害时农药的使用直接导致养殖虾死亡或严重影响其成活率，影响虾的产量[8]。有研究表明：在使用农药过程中，仅有1%作用于植物上，其余部分间接或直接进入土壤水体中，对养殖对象造成不同程度的影响[9]。因此，加强稻田农药对克氏原螯虾的毒性作用及安全性评价，科学指导稻田养殖的合理用药迫在眉睫[10-12]。

百菌清(chlorothalonil，CTN)是一种高效、广谱有机氯杀菌剂，被广泛用于防治水稻真菌性疾病[13]，但是百菌清在土壤中经微生物作用后转化为能溶于水且具有毒性的羟基百菌清[14，15]，可引起虾的毒性效应。目前有关百菌清对克氏原螯虾的急性毒性鲜有报道，无法为克氏原螯虾安全剂量提供科学指导，因此本试验研究了百菌清对克氏原螯虾幼虾的急性毒性，为稻虾养殖中安全合理使用百菌清提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用的克氏原螯虾幼虾购于罗山某养殖场，平均体长5.86±0.10 ㎝，平均体重量3.66±0.15 g，暂养一周后，从中选择210尾大小一致、外表健康的克氏原螯虾进行试验。

试验容器为十格的聚乙烯箱子（59 cm×38 cm×14 cm），购买于信阳一杂货店；量筒1 L、烧杯250 ml、烧杯1000 ml、玻璃棒、定量瓶1 L、分析天平、温度计、pH计、手套、试管刷、硬度计等由郑州生物工程有限公司提供。

百菌清购于江苏南京领先国际化工生物科技集团股份公司。

1.2 方法

试验于2020年4月15日至4月24日在信阳农林学院水产学院水产动物病害实验室进行。自来水经过循环、过滤、增氧后用于试验，试验用水指标为：pH值为6.8～7.3，碱度为1.53 mmol/L；水温为19～21 ℃；总硬度为3.3。

本试验采用静水生物实验法[16]。反复预实验测试确定了正式试验中所用百菌清的浓度范围：400 mg/L、528 mg/L、696 mg/L、919 mg/L、1213 mg/L、1600 mg/L，无药物添加为空白对照，每个浓度设置3个平行，10尾虾一组，共21组。为避免虾之间互相争斗而影响实验结果，每个格内放虾一尾，每个格内加水300 mL。用药后8 h连续观察克氏原螯虾对百菌清的反应，及时捞出死虾，每24 h记录1次死亡率，直至96 h试验结束。

死虾判定标准为：用玻璃棒轻轻触碰克氏原螯虾腹部，1 min内克氏原螯虾不做出任何反应，判定该虾死亡。

1.3 数据的处理

用改良寇氏法计算半致死浓度（LC50），计算公式为：

LC50=log-1[Xm-i(∑p-0.5)] （1）

其中：Xm为最大剂量组剂量的对数值，i为相邻两组剂量对数值之差，P为各组动物的死亡率，∑p为各组动物死亡率之和。

通过24 h LC50和48 h LC50，计算出安全浓度（SC）。计算公式为：

SC=48 h LC50×0.3×（24 h LC50×48 h LC50-1）-2（2）

2 结果与分析

2.1 克氏原螯虾幼虾的急性毒性试验致死结果

不同百菌清浓度下克氏原螯虾幼虾死亡情况见表1。从结果可见，在相同试验条件下，克氏原螯幼虾的死亡率与百菌清浓度呈正相关，浓度越大，死亡率越高，同时和暴露时间呈正相关，暴露时间越长，死亡率越高。

2.2 百菌清对克氏原螯虾幼虾的半数致死浓度和安全浓度

根据表1的数据，运用公式（1）和公式（2）计算出在不同时间段的半数致死浓度和安全浓度。结果见表2，百菌清的24 h、48 h、72 h、96 h 的LC50分别为1939.3 mg/L、1256.8 mg/L、898.2 mg/L、823.2 mg/L；安全浓度为158.4 mg/L。

2.3 克氏原螯虾幼虾的急性毒性反应

开始中毒时，克氏原螯虾幼虾的运动稍频繁急躁，身体泛白，后期身体蜷缩活动减少，直到最后挣扎死亡，死亡时有的侧卧或仰卧于箱底，有的平趴着身体僵硬死亡。在开始实验的8 h内，百菌清浓度为400 mg/L、528 mg/L的实验组中幼虾活动与对照组一样正常；浓度1600 mg/L实验组中开始出现中毒反应，身体蜷缩泛白，24 h内开始出现个别活动剧烈、急躁挣扎死亡；其他浓度试验组随时间增加出现不同程度中毒状况，死亡率升高。百菌清浓度400 mg/L和528 mg/L实验组中最后存活个体活动减弱、掉肢。

3 讨论

3.1 百菌清对克氏原螯虾幼虾的急性毒性强度

百菌清对克氏原螯虾的24 h、48 h、72 h、96 h半数致死浓度分别为1939.3 mg/L、1256.8 mg/L、898.2 mg/L和823.2 mg/L，安全浓度为158.4 mg/L。依据国家《化学农药环境安全评价实验准则》GB/T 31270.21-2014（大型甲壳类生物毒性试验）：96 h LC50≤0.1 mg/L时为剧毒性，0.1 mg/L＜96 h LC50 ≤1 mg/L为高毒，1 mg/L＜96 h LC50 ≤10 mg/L为中毒性，96 h LC50 ＞10 mg/L为低毒性[17]。百菌清的96 h LC50为823.2mg/L，已经远远超出了低毒性范围，可以判定百菌清对幼虾急性毒性为低毒。

3.2 百菌清在稻虾综合种养田中使用的安全性评价

百菌清是一种高效、广谱杀菌剂，常用于防治水稻、小麦、蔬菜等作物真菌病害[13]，其作用机制是能够与真菌细胞中的3-磷酸甘油醛脱氢酶发生作用，影响酶的活力，使细胞代谢受到破坏，进而破坏或干扰菌体的生长和繁殖，达到抑菌目的[18]。百菌清对鱼类及水生无脊椎动物有剧毒[19]，可导致大鼠肌肉失调、呼吸加速、躁动不安和后代生命力退化等现象[20]。国家标准GB 2763—2014规定谷类作物稻谷的最大残留限量为0.2 mg/kg[21]。本试验结果表明，百菌清对克氏原螯虾幼虾的安全浓度为158.4 mg/L，稻田最大残留量对克氏原螯虾幼虾基本无毒，理论上不会造成克氏原螯虾的死亡。但在生产过程中，由于药物推荐剂量往往不能有效防治疾病，需要两倍三倍甚至十倍以上推荐剂量才能起到杀菌效果，经常会有养殖者加大推荐剂量后会引起克氏原螯虾的死亡。还有温度对药物毒性的影响很大，一般来讲，药物毒性随温度的升高而增强[22]。在高温季节使用百菌清毒性应该比本试验结果毒性要高，因此在高温季节使用一定要合理控制用量，科学用药。

喷洒药物时应向上喷着在植株上，尽量避免喷液滴漏，特别在浅水区更应该注意。喷药前可将虾驱赶至虾沟中，可避免直接接触药物。注意及时观察虾的活动情况，适当加注新水。在喷撒农药进行治疗后，应及时换水，避免过多药物残留，在喷药前也可适当往稻田加水5 cm～10 cm，施药过后再适当换水，以减少百菌清对克氏原螯虾幼虾的毒性。也可对稻虾综合种养稻田分段用药，在稻田的一段施药，过一段时间在另一段施药，让虾有安全的躲藏空间。