二黄益肾汤质量标准的建立

李冬冬 田雪芬 王 静 周 玮 张丹丹

山东省济宁市中医院，山东 济宁 272037

二黄益肾汤是我院肾病科老中医以中医药理论为指导，结合多年的临床经验，总结出的经验方，是由丹参、黄芪、大黄、炒白术、炙淫羊藿、莪术、砂仁、石苇等10味中药采用传统工艺结合现代技术制成的口服液体剂型，具有补肾健脾、活血通络、清热泄浊之功效，可降低内生肌酐和尿素氮水平，临床上主要用于气虚湿瘀型慢性肾功能不全的治疗。该方疗效显著，不良反应小，使用安全，深受广大患者的好评。方中大黄为君药，性苦、寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经之功效。现代药理学研究表明，大黄素能明显减轻单侧输尿管结扎肾间质纤维化模型大鼠肾组织病理学损伤程度，且大鼠肾组织PDGF-B表达明显减少，说明大黄素能够减缓肾组织纤维化进程，具有肾脏保护作用[1]；大黄酸可抑制TGF-β1诱导的HBZY-1大鼠肾小球系膜细胞的增殖，可以降低血清肌酐、血尿素氮和24 h尿蛋白水平[2]。

二黄益肾汤现行标准只有【性状】及【检查】项，无【鉴别】与【含量测定】项，现行标准不完善。为有效控制本制剂的质量，完善质量控制标准，保障临床用药的安全、有效，故对丹参和黄芪采用TLC进行定性鉴别，对大黄中的大黄酸、大黄素和大黄酚采用RP-HPLC进行定量测定，本研究从TLC和RP-HPLC两方面入手，建立该产品的质量控制标准。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津)；AB135-S型十万级电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；ZF-8暗箱三用紫外分析仪(上海一科仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂 丹参对照药材(批号120923-201615)；黄芪对照药材(批号120974-201612)；大黄酸(纯度≥99%，批号110757-201607)；大黄素(纯度≥98%，批号110756-201512)；大黄酚(纯度≥99%，批号110796-201621)；黄芪甲苷(纯度≥97%，批号110781-201717)均来自于中国食品药品检定研究院。

二黄益肾汤(规格：每瓶150 mL，济宁市中医院制剂室制，批号：20181014、20181129、20181227)。

甲醇(色谱纯，Avantor Performance Materials, Inc., USA; GC≥99.9%)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别[3]

2.1.1 丹参[4]取本品(批号20181014)20 mL，加10%稀盐酸调pH至2.0，再用乙酸乙酯振摇提取2次，每次50 mL，合并两次提取液，挥干乙酸乙酯，残渣加甲醇2 mL使溶解，即得供试品溶液。取除丹参以外的其余药材，按二黄益肾汤的处方和工艺制成溶液，再按供试品的制备方法处理，即得阴性对照溶液。再取丹参对照药材0.6 g，加水100 mL，加热回流1.5 h，滤过，滤液浓缩至约20 mL，放冷，按供试品的制备方法处理，即得对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，依次吸取对照药材溶液5 μL、供试品溶液8 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(10∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷3%三氯化铁乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，阴性对照无干扰。如图1所示。

2.1.2 黄芪[5-7]取本品(批号20181014)25 mL，用水饱和的正丁醇振摇提取3次(首次轻轻振摇)，每次40 mL，合并提取液，用氨液洗涤 2 次(50 mL、30 mL)，弃去氨液，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，每次30 mL，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，即得供试品溶液。取除黄芪外的其余药材，按二黄益肾汤的处方和工艺制成不含黄芪的溶液，再按供试品的制备方法处理，即得阴性对照溶液。取黄芪对照药材2.0 g，加水50 mL，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至约20 mL，同法即得对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成l mg·mL-1的溶液，即得对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取对照品溶液和对照药材溶液各4 μL、供试品溶液8 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置超过6 h的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，相应位置处阴性对照无斑点。如图2所示。

2.2 含量测定

2.2.1 对照品混合储备液的制备 分别精密称取大黄素对照品、大黄酸对照品和大黄酚对照品各2.13、6.66和2.22 mg，分别置于5 mL、1 mL和2 mL量瓶中，用甲醇至刻度，摇匀，各吸取1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得0.0426 mg·mL-1大黄素对照品、0.666 mg·mL-1大黄酸对照品和0.111 mg·mL-1大黄酚对照品混合储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备[3,8-10]精密量取样品(批号20181129)50 mL，置烧瓶中，加8%盐酸100 mL，超声处理3 min，再加三氯甲烷150 mL，水浴回流40 min，放冷，三氯甲烷层置分液漏斗中，再用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，上层酸液再用150 mL三氯甲烷水浴回流一次(20 min)，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次100 mL，合并提取液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，转移至50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件[11-13]Purospher star RP-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；以甲醇-0.1%磷酸溶液(70∶30)为流动相；检测波长为255 nm；柱温为25 ℃；流速1.0 mL·min-1。

2.2.4 线性关系考察 精密量取2.2.1项下的对照品混合储备液，用甲醇逐级稀释成41.625、83.25、166.5、333.0、499.5、666.0 μg·mL-1的大黄酸对照品和2.663、5.325、10.65、21.3、31.95、42.6 μg·mL-1的大黄素对照品以及6.94、13.88、27.75、55.5、83.25、111.0 μg·mL-1的大黄酚对照品混合溶液，不同浓度的对照品混合溶液各进样8 μL，按2.2.3项下色谱条件进行测定，记录对应峰面积。以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，得大黄酸的回归方程为Y=6472.816X-5364.543，r=1.000 0，线性范围为41.625～666.0 μg·mL-1；大黄素的回归方程为Y=27439.750X-26299.681，r=0.999 9，线性范围为2.663～42.6 μg·mL-1；大黄酚的回归方程为Y=13646.903X-23053.364，r=0.999 9，线性范围为6.94～111.0 μg·mL-1。

2.2.5. 方法学验证[14-15]

2.2.5.1 精密度试验 取2.2.1项下对照品混合储备液6 μL，注入色谱仪中，按2.2.3项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算大黄酸、大黄素和大黄酚RSD分别为1.36%、1.08%和1.44%。结果表明，仪器精密度较好。

2.2.5.2 稳定性试验 取2.2.2项下供试品溶液5 μL，注入色谱仪中，按2.2.3项下色谱条件操作，分别于0、4、8、12、16、24 h间隔下进样，记录峰面积，计算大黄酸、大黄素和大黄酚RSD分别为2.26%、2.98%和2.89%。由结果可知，供试品中的3种化合物在24 h内稳定。

2.2.5.3 重复性试验 取同一批号样品(批号20181129)，按2.2.2项下方法制成6份供试品溶液，按2.2.3项下色谱条件操作，均进样1次，记录峰面积，计算大黄酸、大黄素和大黄酚RSD分别为2.29%、2.06%和2.18%。由结果可知，方法重复性良好。

2.2.5.4 加样回收率试验 平行取6份已知含量的同一批号样品(批号20181129)各50 mL，分别加入含量相当量80%、100%、120%的大黄酸、大黄素和大黄酚混合对照品，按2.2.2项下的方法制备成溶液，每次进样5 μL，结果见表1。大黄酸平均回收率为97.45%，RSD为0.39%；大黄素平均回收率为98.63%，RSD为1.18%；大黄酚平均回收率为98.15%，RSD为0.89%。

表1 回收率试验结果 (n=6)

续表1 表1 回收率试验结果 (n=6)

2.2.6 专属性 按处方和工艺制成不含大黄的阴性对照样品，再按2.2.2项下方法制成阴性对照溶液。标准品混合储备液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL进样，按上述色谱条件进行测定。混合标准品、供试品和阴性对照的HPLC图如图3所示。

2.2.7 定量限、检测限 取对照品溶液逐级稀释，取信噪比S/N为10的作为定量限，大黄酸、大黄素和大黄酚的定量限分别为4.386、5.532、9.470 ng；取信噪比S/N为3的作为检测限，分别为2.525、4.056、6.061 ng。

2.2.8 样品含量测定 取3批样品，按2.2.2项下方法平行制备两份，分别测定，计算二黄益肾汤样品中大黄酸、大黄素和大黄酚含量，结果见表2。

表2 二黄益肾汤中大黄酸、大黄素和大黄酚含量测定结果 (mg·mL-1，n=3)

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别 二黄益肾汤主要是由大黄、丹参、黄芪、炙淫羊藿、炒白术、莪术等10味中药组成，其中大黄为君药，丹参、黄芪等为臣药，现行标准无薄层鉴别项，因此定性鉴别选择方中的臣药加以研究。

黄芪的薄层鉴别中，样品用水饱和的正丁醇提取后再用氨水洗涤，薄层展开时发现杂质较多，斑点相互有干扰，因此样品处理时最后添加了正丁醇饱和的水洗涤这一步骤，可以除去样品中极性较小的杂质；用三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂进行鉴别时，发现10 ℃以下放置超过6 h的展开剂能有效降低斑点的拖尾，可以得到较好的展开效果。

3.2 含量测定 大黄作为方中的君药，具有降低尿素氮、保护残存肾功能、延缓肾纤维化等作用，其有效成分主要以蒽醌类为主，分为结合蒽醌和游离蒽醌，游离蒽醌的成分有大黄素、大黄酸和大黄酚等，这些都是大黄发挥药效的活性物质[16]。大黄在提取过程中，游离蒽醌的损失量远高于结合蒽醌，导致游离蒽醌在溶液中的含量很低；另外，游离蒽醌在口服后，易在上消化道部位吸收[17]，最终到达大肠的量极有限，因此本试验对总蒽醌进行定量测定。

样品处理时，参考2015版《中华人民共和国药典》大黄含量测定中总蒽醌的处理方法，先用8%盐酸进行酸水解，再用三氯甲烷萃取。但封淑华等[18]报道酸水解时酸的浓度对大黄酸有较大影响，对其他物质影响极小，因此本试验中酸的浓度直接采用2015版《中华人民共和国药典》大黄供试品溶液的制备方法。

参考文献[11-12,19]，流动相先后尝试了甲醇∶0.1%磷酸水溶液70∶30、76∶24、80∶20、85∶15等多种洗脱程序，其中76∶24时大黄酸主峰与其前面的杂质峰连在一起，随着甲醇比例的提高，大黄酸主峰与杂质峰近乎无法分离开。之后将甲醇的比例在70%左右调节，综合比较其分离度、拖尾因子、峰面积和经济性等指标，最终选定甲醇∶0.1%磷酸水溶液70∶30作为本试验的流动相系统。

本试验使用二极管阵列检测器(PDA)进行全波长扫描(190～800 nm)，结果发现大黄样品在255 nm处3个成分具有较大的吸收，且杂质成分干扰少，故以255 nm作为大黄的检测波长。

4 结论

本研究建立的质量控制方法，经过对多批产品的验证，结果表明薄层色谱法中斑点分离效果好，阴性溶液对样品的定性鉴别无干扰，方法的专属性较强。含量测定试验，具有良好的重复性，加样回收率高，定量结果准确可靠。增加的薄层色谱鉴别和含量测定项，能有效控制二黄益肾汤的质量，对二黄益肾汤质量标准的制定有一定提高作用。