乳酸杆菌和沙门氏菌对BALB/c鼠感染旋毛虫的影响

姜海燕，陈云雨，张西臣

·论著·

乳酸杆菌和沙门氏菌对BALB/c鼠感染旋毛虫的影响

姜海燕，陈云雨，张西臣

714100 安徽，渭南职业技术学院医学院中药教研室（姜海燕）；241002 安徽，皖南医学院药物筛选与评价研究所（陈云雨）；130062 长春，吉林大学动物医学学院（张西臣）

分析保加利亚乳酸杆菌、沙门氏菌及培养上清对旋毛虫感染的 BALB/c 鼠体内成虫与肌幼虫荷虫量的影响，旨在为旋毛虫病的防治提供新思路，如以肠道菌为资源制成的疫苗或其他药物制剂。

通过 Real-time PCR技术对小鼠肠道菌群定量分析，确认保加利亚乳酸杆菌和沙门氏菌定植；感染旋毛虫 5 d 后，分析小鼠体内成虫荷虫量变化；感染旋毛虫 35 d 后，分析小鼠体内肌幼虫荷虫量变化。

保加利亚乳酸杆菌和沙门氏菌均能促进小鼠排虫，分别引起成虫减少 45.3% 和 22.3%，培养上清效果稍差，分别减少了 29.0% 和 14.8%；两者分别引起肌幼虫减少 54.0% 和 38.3%，培养上清分别引起肌幼虫减少 43.7% 和 37.7%。

保加利亚乳酸杆菌和沙门氏菌均能够保护 BALB/c 鼠减少旋毛虫的感染。

保加利亚乳酸杆菌； 沙门氏菌； 旋毛虫

旋毛形线虫（）简称为旋毛虫，由其感染引起的旋毛虫病，是一种危害严重的人兽共患病[1]。目前，此病治疗仍以使用甲苯咪唑等药物驱杀为主，化学药物长期和不规范应用导致寄生虫对传统药物已产生抗药性，免疫预防将成为该类疾病防控的最佳途径。

旋毛虫生活史中肌幼虫发育到成虫及孵育新生幼虫阶段都在胃肠道中，期间与肠道菌紧密接触。彼此之间必然相互影响。近年来，肠道菌及肠道菌和寄生虫的相互关系已成为科学界研究的热点。曼彻斯特大学的科研人员将几种不同的肠道菌与鼠鞭虫体外共培养发现，大肠杆菌能够通过鞭毛与鼠鞭虫直接接触，促进鼠鞭虫的孵育[2]；反过来，寄生虫也能影响肠道菌群的构成，如旋毛虫感染小鼠后，引起小肠中乳酸杆菌比例增加和结肠中梭杆菌比例的提高[3]。但是，细菌如何影响旋毛虫感染需要进一步研究。

通过分析乳酸杆菌和沙门氏菌对旋毛虫感染的 BALB/c 鼠体内成虫及肌幼虫荷虫量变化的影响，为更深入了解肠道菌与寄生虫及宿主之间关系提供理论基础，并为寻找新型抗寄生虫药物提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌株 保加利亚乳酸杆菌（，）ATCC 11842由吉林大学食品科学与工程学院赠予；肠沙门氏菌（，）ATCC 9115 由军事科学院十一所赠予。

1.1.2 实验动物和虫株 BALB/c 健康小鼠，雌性，3 周龄，清洁级，购于长春市生物制品所实验动物中心；SD 大鼠保种的旋毛虫由吉林大学动物科学学院寄生虫实验室提供。

1.1.3 试剂 DNA Ladder、DNA 凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒为天根公司产品；荧光定量 PCR 引物由上海生物工程有限公司合成；其他试剂购自鼎国昌盛生物公司。

1.2 方法

72 只雌性健康 BALB/c小鼠随机分为乳酸杆菌组、乳酸杆菌培养上清组、沙门氏菌组、沙门氏菌培养上清组、对照组、空白对照组，共 6 组，每组 12 只。每日给小鼠饮用添加 5 mg/L 环丙沙星的高压灭菌水，持续一周。然后，乳酸杆菌组和沙门氏菌组小鼠分别每日灌胃乳酸杆菌和沙门氏菌各 1 × 109CFU；乳酸杆菌培养上清组和沙门氏菌培养上清组小鼠分别每日灌胃乳酸杆菌和沙门氏菌的培养上清各 0.1 ml（培养 24 h，5000 ×离心 10 min）；对照组和空白对照组小鼠每日灌胃生理盐水各0.1 ml。连续灌胃 7 d，停止灌胃 24 h 后，收集各组小鼠粪便，通过 Real-time PCR 技术对小鼠粪便进行菌群定量分析，确认保加利亚乳酸杆菌和沙门氏菌定植后，除空白对照组外，各组小鼠经口感染旋毛虫肌幼虫 300 条/只，5 d 后，将每组中 6 只小鼠断颈处死，取出小肠，纵向剖开，37 ℃生理盐水中孵育 4 h，显微镜下计数小鼠肠道成虫数量[4]。感染 35 d 后，将每组剩余 6 只小鼠剖杀，不同部位肌肉经 1% 胃蛋白酶和 1% 盐酸消化，分析每克肌肉中旋毛虫肌幼虫数量。

1.3 统计学处理

所有实验数据使用 SPSS6.0 软件进行统计分析。

2 结果

2.1 肠道菌定植

每日给小鼠灌胃 1 × 109CFU 的细菌，连续一周，利用实时荧光定量 PCR 技术对肠道菌群进行定量分析，结果显示，与空白对照组相比，乳酸杆菌组及沙门氏菌组中，乳酸菌属和沙门氏菌属的数量明显增加（≤ 0.01），表明保加利亚乳酸杆菌和沙门氏菌分别在肠道内成功定植。

2.2 BALB/c 小鼠肠道内成虫荷虫量变化

感染旋毛虫 5 d 后，保加利亚乳酸杆菌和沙门氏菌均不同程度引起小鼠体内旋毛虫荷虫量变化。其中，乳酸杆菌及其培养上清分别引起成虫荷虫量减少 45.3% 和 29.0%，沙门氏菌及其培养上清分别引起成虫荷虫量减少 22.3% 和 14.8%（表 1）。

2.3 BALB/c 小鼠体内肌幼虫荷虫量变化

感染旋毛虫 35 d 后，与对照组相比，乳酸杆菌及沙门氏菌分别引起小鼠肌幼虫减少 54.0% 和 38.3%，培养上清效果稍差，但也分别引起肌幼虫减少 43.7% 和 37.7%（表 2）。

3 讨论

为了研究保加利亚乳酸杆菌和沙门氏菌定植小鼠肠道后对旋毛虫感染小鼠的影响，首先要确保两者能够在机体内定植。传统的细菌计数方法具有耗时长和计数结果误差相对较大等缺点，实时荧光定量PCR 技术更适合对粪便样品中细菌定量检测。

实验结果显示，外源性保加利亚乳酸杆菌能够帮助小鼠降低旋毛虫感染，培养上清也有类似作用，可能与该菌分泌的某种未知分子有关，或者乳酸杆菌诱导了 Th1 型细胞因子 IL-12 和 IFN-γ 的表达[5]，从而激活巨噬细胞使机体迅速获得针对旋毛虫抗原的特异性免疫因素。益生菌在抗肠道寄生虫感染中的作用已得到证实[6]，尽管之前的研究结果显示，体外乳酸杆菌对旋毛虫活力有促进作用[7]，实验结果表明，宿主受寄生虫感染情况下，乳酸杆菌对宿主更有利。乳酸杆菌的益生作用、宿主免疫应答和与旋毛虫清除三者之间可能存在某种复杂联系，其具体抗虫作用分子机制仍需深入探索。

表1 乳酸杆菌和沙门氏菌对小鼠体内旋毛虫成虫荷虫量影响（感染5 d）

Table 1 Effect ofandoral treatment on the number of adult worms in mice, five days after thechallenge

组别GroupsBALB/c 鼠数量（只）Number of mice成虫荷虫量（）Adult worm recovery ()成虫减少率（%）Reduction comparedwith control (%)P 值P value 对照组 Control6148.5 ± 10.5 乳酸杆菌组 L. bulgaricus681.7 ± 10.145.3< 0.01 乳酸杆菌上清组 Supernatant L. bulgaricus culture6105.5 ± 9.629.0< 0.05 沙门氏菌组 S. enterica6115.2 ± 14.022.3< 0.05 沙门氏菌上清组 Supernatant S. enterica culture6126.5 ± 11.114.8< 0.05

表2 乳酸杆菌和沙门氏菌对小鼠体内旋毛虫肌幼虫荷虫量影响（感染35 d）

Table 2 Effect ofandoral treatment on the number of larvae per gram of muscle tissue in mice, 35 days after thechallenge

组别GroupsBALB/c 鼠数量（只）Number of mice肌幼虫荷虫量（）Larvae per gram muscletissue ()肌幼虫减少率（%）Reduction comparedwith control (%)P 值P value 对照组 Control61698.0 ± 84.2 乳酸杆菌组 L. bulgaricus6781.5 ± 91.454.0< 0.01 乳酸杆菌上清组 Supernatant L. bulgaricus culture6956.5 ± 81.643.7< 0.01 沙门氏菌组 S. enterica61048.3 ± 92.438.3< 0.01 沙门氏菌上清组 Supernatant S. enterica culture61058.2 ± 67.837.7< 0.01

沙门氏菌作为一种人兽共患病原菌，在体外单独与旋毛虫培养，可抑制旋毛虫的存活与繁殖[7]。在体内定植后，减少了旋毛虫成虫与肌幼虫荷虫量，类似效果在重组减毒株沙门氏菌可保护小鼠不受寄生虫感染的研究中也被发现[8]。但降低旋毛虫感染作用没能达到体外共培养结果预期的效果，可能感染旋毛虫引起肠道菌群中益生菌的恢复导致。

我国仍然是世界上旋毛虫病危害最为严重的少数几个国家之一，科研人员一直寻找新的防治策略和方法，乳酸杆菌和沙门氏菌能够降低旋毛虫对宿主的感染，在影响寄生虫侵入宿主及建立其长期寄生生活有潜在的应用价值，作用机制可能与分泌某种特殊蛋白分子有关，研究结果有助于进一步了解宿主-多病原体相互作用的机制，并为以乳酸菌或减毒肠道沙门氏菌为载体的寄生虫疫苗及其他制剂的研制提供理论基础，在此基础上的应用需要更深入的研究。

[1] Pozio E. World distribution of Trichinella spp. infections in animals and humans. Vet Parasitol, 2007, 149(1-2):3-21.

[2] Hayes KS, Bancroft AJ, Goldrick M, et al. Exploitation of the intestinal microflora by the parasitic nematode Trichuris muris. Science, 2010, 328(5984):1391-1394.

[3] Walk ST, Blum AM, Ewing SA, et al. Alteration of the murine gut microbiota during infection with the parasitic helminth Heligmosomoides polygyrus. Inflamm Bowel Dis, 2010, 16(11):1841-1849.

[4] Manson-Sith DF, Bruce RG, Parrott DMV. Villous atrophy and expulsion of intestinal Trichinella spiralis are mediated by T cells. Cell Immunol, 1979, 47(79):285-292.

[5] Sun J, Shi YH, Le GW, et al. Lactobacillus modulate host immune response through colonization and provision of immune signals. Sci Technol Rev, 2006, 24(2):43-46. (in Chinese)

孙进, 施用晖, 乐国伟, 等. 乳酸杆菌通过定植和提供免疫信号调节宿主免疫反应. 科技导报, 2006, 24(2):43-46.

[6] Mukhopadhyay B, Ganguly NK. The unexplored role of probiotics on the parasitic pathogens. Food Nutr Sci, 2014, 5(22):2177-2184.

[7] Jiang HY, Zhao N, Zang QL, et al. Intestinal microbes influence the survival, reproduction and protein profile of Trichinella spiralis in vitro. Int J Parasitol, 2016, 46(1):51-58.

[8] Konjufca V, Wanda SY, Jenkins MC, et al. A recombinant attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine encoding Eimeria acervulina antigen offers protection against E. acervulina challenge. Infect Immun, 2006, 74(12): 6785-6796.

Effect ofandoninfected BALB/c mice

JIANG Hai-yan, CHEN Yun-yu, ZHANG Xi-chen

The aim of the present study is to evaluate the effects of(),() and their supernatants from culture on the percentage of adult worm and larvae in mice infected by(), thus providing a new way for the prevention and treatment of trichinosis.

Quantitative analysis of the intestinal flora was performed using the real-time quantitative PCR technique. The percentage of adult worm and larvae reduction in the intestine at different days afterinfection were compared with the control group.

The percentage of adult worm was reduced by 45.3% and 22.3% in mice treated withand,respectively, compared with control group, while the percentage of adult worm was reduced by 29.0% and 14.8% respectively after treatment with supernatants from culture, at day 5 afterinfection. The percentage of larvae per gram of muscle tissue was reduced by 54.0% and 38.3% after treatment withand, respectively, as compared with controls, while the percentage of larvae was reduced by 43.7% and 37.7% in mice treated with respective supernatants, at day 35 afterinfection.

,and the supernantants from culture could protect againstinfection.

;;

ZHANG Xi-chen, Email: xczhang@jlu.edu.cn

渭南职业技术学院院级科研课题（WZYZ201708）

张西臣，Email：xczhang@jlu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.007

Author Affiliations:Weinan Vocational & Technical College, Shannxi 714100, China (JIANG Hai-yan); Institute for Drug Screening and Evalution, Wannan Medical College, Anhui 241002, China (CHEN Yun-yu); College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China (ZHANG Xi-chen)

2020-05-11