新发传染病病原微生物核酸检测实验室的思考

高鹏，赵晓霞

·新型冠状病毒专栏·

新发传染病病原微生物核酸检测实验室的思考

高鹏，赵晓霞

050021 石家庄市第五医院检验科

核酸检测是传染病病原学诊断的直接证据之一。保证生物安全是病原学检测的最基本要求，为此在COVID-19 疫情中，卫生行政主管部门专门制定并发布了《新型冠状病毒实验室生物安全指南》[1]。实验室生物安全是指以防止发生病原体或毒素无意中暴露及意外释放的防护原则、技术以及实践[2]，具体包括基础设施设备、操作规范、个人防护以及生物废弃物处理等方面。遵从生物安全实验室要求的良好行为规范，可以有效避免操作人员感染以及可能由此形成的社区传播。在具体实践中，根据《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》要求建设的 PCR 实验室在开展 2019-nCoV 样本检验过程中存在安全风险[3]。

本文着重从 2019-nCoV 病毒核酸检测的具体实践出发，探讨新发病原微生物核酸扩增检验与其他临床检验工作，对实验室场地分区和流程的优化和再造提出几点实践思考，为后续应对可经呼吸道传播的高致病性微生物病原学检测提供一些参考与启示。

1 实践思考

随着近年经济、技术的快速发展，以及国外新发传染病的警示，检验机构对涉及生物安全的标本检验无论在硬件还是软件方面都有了长足的进步。但在 COVID-19 疫情的应对中，仍暴露出不足。在新发传染病疫情早期，对病原微生物本身及其疾病诊疗和转归的认识不足，其临床检验工作具有新的要求。为了将新发疫情病原高风险标本的检测独立于日常检验工作，不影响正常的诊疗检验程序，新发传染病临床检验所涉及的硬件建设流程布局、管理体系、人员配置三个方面都应另行储备。在新建、改建、提升过程中，应考虑以下三个方面的兼顾统筹，包括基因扩增实验室与生物安

全实验室不同侧重要求的兼顾、现有通用技术与新兴/应急技术的兼顾、病原微生物核酸检测与高风险标本培养检测的兼顾。

1.1 兼顾基因扩增检测与生物安全

检测未知的高致病性病原微生物，最重要的是操作过程中的生物安全。临床实验室要遵从相关标准，如 GB 50346-2011《生物安全实验室建筑技术规范》、GB 19489-2008《实验室生物安全通用要求》、WS 233-2017《病原微生物实验室生物安全通用准则》。在此基础上要遵从针对性的指南——《新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）》。对于 2019-nCoV，《指南》表明该病原体暂按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理，未经培养的感染性材料的操作，采用生物安全三级实验室的个人防护。据《人间传染的病原微生物名录》中对于大多数第二类病原微生物的操作要求，灭活材料的操作在 BSL-1 实验室进行，未经培养的感染材料的操作在 BSL-2 实验室进行，但对 SARS 冠状病毒灭活材料和其未经培养的感染材料的操作均要求高一级别。在新发传染病病原微生物检测中，采用常规的 56 ℃处理能否有效灭活病原微生物存在未知性，基于以往 SARS 冠状病毒的检测要求，应采用接近 BSL-3 的加强型 BSL-2 实验室开展检测。

以 PCR 技术为基础的病原微生物核酸检测，在临床检验过程中要遵从相关要求，如《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》。该《办法》及其附件明确细致地规定了该类实验室规范，保证了检验结果的准确性，对于生物安全要求所有操作符合 GB 19489-2008《实验室生物安全通用要求》。

生物安全二级/三级实验室和基因扩增实验室的核心诉求不同，生物安全实验室注重防范病原微生物的感染、泄漏，而基因扩增实验室更加注重防范阳性扩增产物的环境污染，其不同导致底层设计方面具有一定差异。新发高致病性传染病的病原微生物检测要同时兼顾两种实验室的要求，具有一定的挑战性。在两种类型实验室的具体操作实践中，具有一定的差异性，整理如表 1 所示。

设计核心的不同，形成了两种实验室不同设计格局。防止病原微生物和扩增产物气溶胶污染分别是两种实验室的防范要点，导致了人流、物流、气流的不同方向。为兼顾两者，暂提出两种方案。

方案一，在标本制备区和扩增区进行分区建设的情况下，另设污染走廊。污染走廊的设置主要有以下两个用途：一是为实验人员提供穿梭途径，回避在洁净走廊观察、保障支持的人员；二是更好地管理人流和物流，实验人员和医疗废弃物从污染走廊退出。尽量保证各实验区之间无人员穿梭（每个实验区配专人作业）或从污染走廊单向穿梭。各实验区密封良好的情况下，保证气流从标本制备区流向扩增区（扩增区气压更低），特定开通气流定向流动通道并加装高效 HEPC 滤器，防止扩增区被病原微生物污染。

表 1 基因扩增检验实验室与加强型生物安全二级实验室的实践差异

方案二，样本制备区与扩增区合并为核心工作区，核心工作区全部处于生物安全二级防护之中。在具体操作中，可以根据设备对样本的处理流程不同，建设为一体化整体，或是建设为具有单独 PCR 扩增间的整体。分别配备整合样本处理与扩增的设备，或分别进行样本处理与扩增的独立设备。加强气流管理，采用上进下出的气流组织方案[4]，通过气帘等方式，形成核心工作区不同操作区域的隔离，且在实际工作中，减少不同区域的穿梭。

以上两种方案，均需加强扩增产物终末处理管理和室内 PCR 产物气溶胶污染监测，防范扩增产物污染导致的对实验结果的影响。其中，阳性参照品、阳性标本、阳性扩增产物须经完整包装，并通过传递窗表面消毒后，在污物处理间进行处置。加强实验室桌面、地面和仪器表面的酸处理（如次氯酸）以及紫外线照射，以降解破坏可能存在的核酸片段。

1.2 兼顾现有技术与新技术

核酸检测技术主要采用两种方法：Taqman 荧光 PCR 法和恒温扩增荧光法[5]。这两种方法的主要步骤有：核酸提取和上机检测，前者主要采用全自动或半自动或手动方案完成基因组提取，后者是在扩增-荧光分析仪上完成（反转录）基因扩增分析。分步式操作决定了核酸检测实验室的格局分布，也是样本制备与 PCR扩增分区操作的原因。

一体式操作检测方案对 PCR 检测工作提出了新的要求。例如，此次在 COVID-19 疫情中，NMPA 应急审批的国械注准 20203400300 体外诊断试剂提供的检测方案，其AutoSAT 采用 RNA 实时荧光恒温扩增检测技术（SAT），使得核酸提取、纯化、扩增检测、报告结果实现了全程一体化。整个反应在密封的环境中，提高了实验的生物安全性。

同样是一体化方案，具有一定 POCT 特性的快速、小通量方案也进入视野。如在 COVID-19 疫情中，一些分子诊断厂商通过研制已上市设备的配套试剂，获得了美国 FDA紧急使用授权（EUA），其中有基于Xpert®Xpress Flu/RSV 匣盒技术的诊断方案，其配套的 Xpert®Xpress SARS-CoV-2 试剂盒靶向病毒基因组的多个区域，可在45 min 左右快速检测 2019-nCoV。该方案的样本前处理时间不到 1 min，加入匣盒即可上机。还有基于 ID NOW™ 系统的诊断方案，可实现在上机后 5 min 左右报告阳性结果，13 min 左右报告阴性结果[6-7]。以上不同诊断方案虽然分别基于荧光 PCR 法和恒温扩增法，但其都具有提取-检测一体化的特征。

在以上两种方案之外，还有一些新技术方案可能在后续形成商品化方案上市。如基于 CRISPR 技术的SHERLOCK分子诊断系统[8-9]和 HOLMES 分子诊断系统[6]，曾应用在寨卡病毒、埃博拉病毒检测中。该两种方案可以实现快速的“纸片化”的可视分子诊断，相信其技术在整合微流控系统后，可以实现通量化的实验室检测。

多种新兴核酸检测技术方案，都以一体化、快速为发展方向。《方法》在 2010 修订版中特别增加了“采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并”的内容。后续实验室建设区域合理划分的基础上，管理体系和流程方案的发展要与之相配套。

1.3 兼顾核酸检测与高风险标本培养检测

对疑似或确证患者的呼吸道标本的细菌培养操作风险较大，在实践中，对此类标本的检测，应设置合理的硬件设施设备与软件流程。已有专家共识提出，条件允许时，新冠样本的检验应安置在相对独立的区域[7]。在此建议，可以在核酸检测的加强型 BSL-2 实验区增加细菌检测房间，配备基本的细菌分离、培养、涂片设备，对应的镜检过程，由于护目镜、防护面屏极易对视野和视线造成影响，建议将样品玻片经固定、封片、紫外照射等灭活操作后，经传递窗转至常规微生物实验室进行。在本次阻击 COVID-19 疫情的应急方案中，对疑似或确证患者的呼吸道标本的处理人员采用BSL-3 个人防护，实验过程既占用微生物 BSL-2 实验室，又需要核酸检测实验室，对人员、环境、防护用品造成不必要的消耗。通过兼顾病原微生物核酸检测与高风险标本培养检测，避免高风险标本培养操作占用常规微生物 BSL-2 实验室，是疫情常态化防控的需求。

2 讨论

在 COVID-19 疫情早期，核酸检测通常在疾控机构和传染病专科医院开展，相对其他基层医疗机构，此类机构人员具有较强的生物安全意识，能够按照相关指南，自主地应急升级、改造现有设施设备，建立良好的操作规范及检验流程。通过合理的流程设计和良好的操作规范，可以在一定程度上弥补应急状态下设施设备不够完备的缺点。然而，许多非传染病医院和基层医疗机构在开展 2019-nCoV 核酸检测过程中，仍应通过合理设置设施设备，强化人员的操作规范来降低生物安全风险。在核酸检测实验室升级、建设过程中，强调生物安全设计，将帮助此类工作人员更好地实现生物安全。

应急升级、改造病原微生物检验实验室的措施，由于条件受限、考虑不足等问题，在实际工作中增加了生物安全风险。随着疫情状态进入常态化，在恢复正常诊疗秩序要求下，建设加强型 BSL-2 病原微生物检测实验室，既满足现有的 2019-nCoV 核酸检测要求，也为下一次可能的疫情暴发做好准备。当然，储备式建设可以有冗余，但也应兼顾成本。在考虑省市级疾控机构和定点医院建立独立的加强型 BSL-2 实验室外，可以考虑各级疾控机构配置相应的可移动式生物安全实验室。在疫情出现时，可移动式生物安全实验室可以充分发挥其快速机动的特点，快速移动到疫情紧迫区域，及时就地展开病原微生物检测工作，形成检验能力[8]。生物安全设施设备建设应保持长期性，坚持公益性和应急属性。

类似生化检验的一体式方案，连续化解决方案是核酸检测的一个重要发展方向。随着疫情防控要求精准化，随到随检、快速出具结果报告的检测策略越来越受重视[9]。该检测策略需要可将样本处理、核酸提取及扩增检测联为一体的自动化分析仪。在实验室布局方面，根据《方法》2019 修订内容，将制备、扩增、分析检测三区合并为一区，则生物安全和核酸检测的防范重点便统一在同一区域——核心实验区，并由此实现兼顾统一。

欧美国家对病原微生物核酸检测的实验室布局有多样化的选择和设计。既有理想化的 4 区分离方案，也有 3 区分离和 2 区分离方案。在 2 区分离方案中，试剂准备和样本制备可以安排在同一区域。在一例埃博拉移动式实验室的配置中，包括主实验室、试剂准备室、模板加样室和 PCR室[10]。主实验室作为整体包含其他三室，并可以分别进入三室，无缓冲区域。核心区负责样本处理如 RNA 提取，还包括 GeneXpert 检测。试剂准备室和模板加样室非常小，仅配有一个层流柜保证洁净操作。该设计方案与本文提出的样品制备与扩增设置为一个区域的设计理念相近。另一方面，国外厂商不断更新的核酸检测设备，无论是通量较小的GeneXpert，还是与现有常用 96 通道同样通量的 Cobas®8800，都对实验室整体一区的布局有促进作用。

本文在探讨过程中，更多地关注在生物安全方向，一定程度上弱化了核酸检测工作中防止检验样本被污染的工作准则。为了同步提高生物安全和核酸检测准确性，除了临床检验人员的努力，还需要检验仪器与试剂开发设计的配合，优化整合从采样、灭活，到标本处理、标本上机，再到核酸分析的全流程。最大程度完成样品在封闭负压环境的全自动处理，尤其是开帽操作和易产生气溶胶的高风险操作（痰、便等类型标本的消化操作等）；最大程度实现检测试剂的单测试预装，避免分装等操作带来的交叉污染。另外，虽然设施设备的硬件建设和储备非常重要，但更要加强生物安全的管理以及人员培训，确保生物安全和检测结果的双达标。

注：本文仅代表作者个人观点，不代表供职单位立场。

[1] National Health Commission of the People's Republic of China. Novel Coronavirus laboratory biosafety guide (second edition). 2020- 01-23. (in Chinese)

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赵晓霞，Email：xiami49568@qq.com

2020-08-24

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.001