葡萄霜霉病菌保存与抗霜霉病鉴定技术

刘长远 ，刘 丽 ，贾 姝 ，赵 达

（1.辽宁省农业科学院，辽宁沈阳 110161；2.沈阳大学，辽宁沈阳 110044）

葡萄霜霉病[Plasmopara viticola（Berk et Curtis）Bert.et Toni]是葡萄生产上第一大病害，在全世界葡萄主产区均有发生。该病主要为害叶片和果实。一般年份产量损失20%～30%[1-2]。葡萄霜霉病菌是专性寄生菌，因不能在人工培养基上繁殖和保存，使该病害及其病原菌的深入研究增加了难度；生产上缺乏客观科学反映葡萄抗霜霉病鉴定和评价技术。针对以上问题开展了葡萄霜霉病菌保存与抗霜霉病鉴定技术研究[3-4]，根据研究结果整理提出了葡萄霜霉病菌保存及快繁方法和葡萄抗霜霉病鉴定技术，打破了葡萄霜霉病菌无法长期保存的技术瓶颈，科学评价品种抗病性，为该病害持续深入研究和有效防治奠定了基础。

1 葡萄霜霉病菌活体叶片保存法

葡萄霜霉病菌活体叶片保存法是经葡萄霜霉病菌分离纯化、葡萄活体叶片接种、容器适温短期保存和叶片冷冻长期保存等步骤。

1.1 病菌分离纯化

采集新鲜葡萄霜霉病病叶，用无菌毛刷蘸取无菌水刷去病叶表面的杂物和白霜状霉层，将该叶片放到垫有湿滤纸的培养皿内，封口膜密封保湿，在22～25℃条件下全光照培养24 h，用无菌毛刷将叶片长出的新鲜孢子囊菌体刷至无菌水中，配制获得1×105个/mL的病菌新孢子囊悬浮液。

1.2 葡萄活体叶片接种

选取葡萄感病品种新鲜离体健康葡萄活体叶片，用无菌毛刷蘸取无菌水刷去叶表面的杂物，叶柄用浸水后的脱脂棉包裹，叶背面朝上置于直径为15cm垫有无菌水浸湿过滤纸的塑料培养皿中，待叶背面水分晾干后立即喷雾接种刚配成的病菌孢子囊悬浮液，封口膜密封保湿，在22～25℃条件下全光照培养5～7 d获得新鲜菌体叶片。

1.3 容器适温短期保存

将接种好病菌叶片的容器放到培养箱冷藏短期保存，在3℃温度下可保存20～30 d。叶片冷冻长期保存，即将接种好病菌的叶片置于自封袋中，然后立即将其放到超低温（-80℃）冰箱中保存，此方法可保存病菌2年以上。

2 葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液保存法

葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液保存法是经病菌保护剂配制、病菌孢子囊悬浮液制备、超低温保存等步骤。

2.1 病菌保护剂配制

将二甲基亚砜和脱脂牛奶按照1∶1比例配制而成。

2.2 保护剂和病菌复配

将病菌保护剂混合液和新配制的病菌孢子囊悬浮液（1×105个/mL）按照1∶9比例复配，最终配制成5%二甲基亚砜+5%脱脂牛奶+90%病菌孢子囊悬浮液的混合液。

2.3 超低温保存

将配置好的混合液立即装入冻存管内，装液量占总容量的3/4，然后将装有混合液的冻存管迅速放入超低温（-80℃）冰箱内保存，此方法可保存病菌3年以上。

3 葡萄霜霉病菌快速繁殖法

葡萄霜霉病菌快速繁殖法是经葡萄健康叶片选择、容器规格、病菌选取和接种扩繁等步骤。

3.1 葡萄健康叶片选择

选取葡萄新梢顶端3～5叶位或叶龄为25～35 d的健康叶片，用无菌水清洗干净叶片，叶柄用浸水后的脱脂棉包裹，叶背朝上置于垫有无菌水浸湿过滤纸的培养皿中。

3.2 容器规格

选取直径为15 cm塑料培养皿装取叶片。

3.3 病菌选取

采用新鲜叶片接种获得的葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液；或由超低温（-80℃）冰箱冷冻长期保存的葡萄霜霉病菌，先经4℃活化3 h，将活化菌种接种新鲜叶片，获得葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液。

3.4 接种扩繁

将配制浓度为1×105个/mL的病菌孢子囊悬浮液，喷雾接种容器内的叶片，用封口膜密封保湿，放置在培养室或培养箱全光照培养，病菌侵染阶段采取22℃培养24 h，以后转入病菌扩展阶段，温度控制在25℃左右，病菌培养7 d后可看到叶片长满白霜状霉层的病菌，实现葡萄霜霉病菌快速大量繁殖。

4 葡萄抗霜霉病鉴定技术

该技术适用于各种葡萄资源对霜霉病抗性的室内外鉴定及评价。

4.1 霜霉病菌接种体制备

葡萄病原菌分离、保存和繁殖采用葡萄霜霉病菌活体叶片保存法、葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液保存法和葡萄霜霉病菌快速繁殖法。

4.2 室内抗性鉴定

4.2.1 鉴定室设置。人工接种鉴定室应具备人工调节温度、湿度及光照的条件，使人工接种后具备良好的发病环境。

4.2.2 鉴定对照材料。选择葡萄抗病和感病品种各1种作为鉴定时的抗病和感病对照品种。

4.2.3 鉴定材料育苗。将待鉴定的葡萄苗定植于花盆内，随机或顺序排列，每份材料重复3次，每重复10株苗。基质为草炭、蛭石和菜田土（2∶1∶1），经高温蒸汽灭菌（134℃，30 min）。在育苗栽培生长室内温度为23～25℃。鉴定时所有幼苗应生长健壮、叶龄一致。

4.3 接种

4.3.1 接种时期和接种浓度。葡萄萌芽展叶后15 d。接种葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液浓度为1×105个/mL。

4.3.2 接种方法与接种后管理。采集每个葡萄品种枝条顶端倒数第2～4位置的健康叶片，无菌水冲洗后，用消毒的打孔器打下直径为1.5 cm圆盘，每个处理重复4次，每重复50叶碟，叶背朝上放入培养皿中，下铺一层灭菌吸湿滤纸，喷布孢子囊悬浮液，密封保湿，22℃下全光照培养。

4.4 病情调查

4.4.1 调查时间。室内接种7～10 d，调查发病情况。

4.4.2 病情级别划分。葡萄霜霉病病情级别标准[5-8]：0级：全叶无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积5%及以下；3级：病斑面积占整个叶面积6%～25%；5级：病斑面积占整个叶面积26%～50%；7级：病斑面积占整个叶面积51%～75%；9级：病斑面积占整个叶面积76%以上。

4.4.3 调查方法。根据病害分级标准调查每份鉴定材料接种发病情况，记载病情级别，计算出病情指数（DI）。

病情指数（DI）计算按下列公式计算：

病情指数=[∑（各级病叶数×相对级数值）／（调查总叶数×9）]×100

4.5 抗病性评价

4.5.1 抗病性评价标准。依据鉴定材料4次重复的病情指数（DI）平均值确定其对霜霉病的抗性水平，品种反应型划分标准按照国际植物种质委员会（IB-PGR）的标准，将其分为 5种类型，即免疫（I）：病情指数为 0；高抗（HR）：病情指数为 0.1～5.0；抗病（R）：病情指数为 5.1～25.0；感病（S）：病情指数为25.1～50.0；高感（HS）：病情指数为 50.1～100.0。

4.5.2 鉴定有效性判别。当感病对照材料达到相应感病程度（DI＞50）时，抗病对照材料与实际抗性程度相符，该批次抗霜霉病鉴定视为有效。

4.6 鉴定材料处理

鉴定完毕后将发病葡萄叶片集中焚烧或深埋处理。

4.7 鉴定记载

葡萄抗霜霉病鉴定结果需记载品种/种质名称及来源、定植日期、接种日期、接种病原菌分离物编号各小区病情级别，计算出病情指数，明确不同葡萄品种室内抗性试验的品种反应型。

4.8 田间抗病性评价

调查不同葡萄品种田间自然条件下发病情况，对葡萄品种进行室外田间抗病评价，比较室内外品种抗病性，对不同葡萄品种做出科学评价。

5 小结

葡萄霜霉病菌属于专性寄生菌，该类病原菌往往都不能在培养基人工培养。该文提出的葡萄霜霉病菌活体叶片保存法、孢子囊悬浮液保存法和快速繁殖法可实现该病菌长短期保存和大量病菌繁殖，这为该病菌短期和长期持续研究提供了技术支撑。葡萄有多种抗病机制，其中结构抗病性是重要机制之一，葡萄有些品种具有浓密的叶背绒毛等结构，在田间自然条件下由于霜霉病菌不易接触叶背表面，这些品种常常表现为良好的抗病性；但在室内抗病性评价时，由于供试葡萄叶片背面向上被放置在培养皿，接种的病菌易于接触叶片表面，并且湿度较大，导致室内外抗病反应类型有时不一致，因此为了准确评价品种抗病类型应采取室内外结合的评价方法对其进行综合判别。利用葡萄抗霜霉病鉴定技术可对葡萄品种和品质资源进行抗病性评价，对选育和推广抗病品种，有效防治葡萄霜霉病具有重要意义。