降低饲料和饲料原料中霉菌毒素技术的研究进展

冯 利，王 兵，赵 欢，薛士科

（河北工业职业技术学院，河北石家庄 050091）

1 前言

真菌毒素是由各种真菌产生的次生代谢物，主要属于曲霉菌、镰刀菌或青霉菌。有证据表明，这些代谢物可能作为毒力因子，增加真菌的生存能力，增加植物致病性，抑制细菌竞争，或作为真菌物种间的化学信号。这些霉菌毒素在农业上造成了严重问题（Audenaert等，2014）。谷物、水果和油籽作物的霉菌毒素污染在全球范围内已造成数十亿美元的损失。在美国，由3种主要真菌毒素（黄曲霉毒素B1、伏马毒素和呕吐毒素）造成的平均经济损失每年估计为2.43亿美元。在动物健康方面，霉菌中毒可引起的不良反应从慢性黄曲霉毒素摄入引起的肝癌到暴露于玉米赤霉烯酮引起哺乳动物的高雌激素血症（Wu等，2014）。猪由于对呕吐毒素的高敏感性，其中毒特点是肠胃炎和免疫毒性，而赭曲霉毒素A是诱发肾病和慢性食道癌的危险因素（Wu等，2014）。由于真菌对动物健康的广泛影响，我们很容易理解为什么大多数国家都制定了饲料和原料中毒素的限量标准。目前对抗霉菌毒素的方法大致可分为两类：收获前控制毒素生产和收获后对受污染商品的脱毒或解毒。虽然已经发表了一些关于饲料中霉菌毒素控制的综述，但这些综述通常基于理论，很少有商业应用的产品（He等，2010）。由于专利技术具有很高的商业化和未被工业利用的可能性，本文综述了近年来在专利出版物中报道的降低饲料中霉菌毒素的最新技术。

2 真菌毒素的脱毒和解毒措施

2.1 物理方法

2.1.1 作物收获后加工的物理脱毒 物理方法有快速干燥，紫外线处理和浸泡等，其目的是减轻收获后的真菌毒素。Miljkovic等（2010）报道，快速干燥（100～180℉，6～48 h）能将含水量降到20%以下，间接减少了全珠咖啡樱桃霉菌毒素水平。Newman（2009）报道了中长波长紫外线A和紫外线B对固体食品中的解毒作用，如在2000 lB/h杏仁的高产量下，几乎100%的黄曲霉毒素在60 s内被去除，这种方法在不影响感官特性的情况下，使食品保持在天然状态，同时提高市场价值。另一种物理分离技术称为浸泡技术，利用受污染谷物和未受污染谷物之间的特定重量差异，通过浸泡去除部分霉菌毒素（Bethke等，2014）。

2.1.2 物理吸附 在畜禽饲料中添加吸附剂的目的是通过阻止真菌毒素通过黏附剂和真菌毒素之间的复杂结构进入动物血液和器官，从而减轻真菌毒素的有害影响。在过去的几十年里，人们研究了各种不同来源的黏合剂对真菌毒素的吸附效果。第一代粘结剂，即所谓的矿物吸附剂或无机吸附剂，主要是粘土矿物群中的硅酸盐，其中最重要的是蒙脱石、水合铝硅酸钠，特别是膨润土或蒙脱石。矿物吸附剂的结合效能与结合剂和真菌毒素的结构有关，吸附剂的电荷分布、表面积、孔径及真菌毒素的电荷分布、极性和形状对整体结合相容性有显著影响（Kabak等，2006）。虽然许多现有的矿物吸附剂能有效隔离黄曲霉毒素，但体内研究发现，它们似乎不能有效地结合其他非黄曲霉毒素，尤其是三聚氰胺。矿物吸附剂具有一定的局限性，包括对维生素、氨基酸和矿物质的吸附，以及络合化学物质对矿物吸附剂的潜在风险。为了克服这些缺点，第二代吸附剂已从微生物的细胞壁成分中开发出来，主要候选微生物包括酵母、乳酸菌和曲霉分生孢子。解毒的机制仍然是物理吸附，由灭活的细胞壁促进，而不是由活的微生物分解代谢真菌毒素，这些细胞壁的多糖、蛋白质和脂质成分通过氢键、离子和疏水相互作用为真菌毒素的附着提供了许多潜在的位点（Ringot等，2007）。如从湿酒糟、干酒糟及其可溶物中获得的酵母生物质，具有结合各种霉菌毒素的能力，其中酵母细胞壁的β-葡聚糖能有效结合玉米赤霉烯酮毒素（Yiannikouris等，2014）。酵母细胞壁与矿物粘土的结合显著增强与真菌毒素的结合能力，在体外研究中，其组合协同作用增强了对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素的解毒作用，但对呕吐毒素、赭曲霉毒素和T2毒素的吸附能力较低。

2.2 化学方法 化学解毒技术涉及使用碱、酸、氧化剂、醛或亚硫酸氢盐来改变真菌毒素的结构或生物利用度。公众对动物饲料和人类食品中潜在有害化学物质日益关注，引导了利用农产品中无害和固有成分脱毒新方法的发展。如甘油被美国食品及药物管理局归类为通用食品添加剂，它在消化系统中无毒，在单胃动物的日粮中是一种有用的能量来源。Venter（2004）报道了一种解毒方法，包括甘油和氢氧化钙混合产生的增强性复合物，甘油由于羟基离子的积聚而增强，具有强大的解毒作用。

2.3 生物方法 以生物为基础的解毒方法被认为是高效、特异、环保的。在不涉及有害化学物质的情况下，营养和感官特征（如颜色和味道）被轻微改变或完全不改变。筛选和分离天然存在的微生物来转化霉菌毒素已成为一种流行的策略。另一种可能的做法是直接应用具有商业价值的生物活性材料，如酶、多肽等。

2.3.1 微生物的脱毒作用 良好的真菌毒素生物控制候选微生物通常来自于一个特定的环境。这些细菌与污染的真菌毒素共存，对参与真菌毒素耐受或耐药的代谢途径保持选择压力，进一步使这些化合物有可能被用作碳源。如在最近的一项专利申请中，通过饲料接触霉菌毒素的鸡大肠内容物表现出高度的生物转化活性，将呕吐毒素转化为毒性较低的衍生物。该菌株180507-1被保存在加拿大国际保藏局，通过16S rRNA序列比对，鉴定为与杆菌序列相似度96%的革兰氏阳性菌（Zhou等，2014）。除了肠道，富含作物碎屑的表层土壤也被证明是生物转化微生物的良好储藏地。IDAC 040408-1标记下的一株微生物是通过筛选来自加拿大的165种农业土壤获得的，这些土壤以前种植过玉米、小麦、大麦、苜蓿、大豆、豌豆、土豆、三叶草、南瓜、烟草、人参、苹果或油菜作物。与IDAC 180507-1菌株不同，IDAC 040408-1可以通过外膜化反应将呕吐毒素转化为主要产物3-呕吐毒素，也可以转化为2个次要产物，包括3-酮-呕吐毒素和1个未知化合物（Zhou和He，2012）。聚合酶链反应扩增和末端限制长度多态性等分子技术有可能降低细菌培养的复杂性。

另一种分离具有理想的霉菌毒素生物转化能力的微生物的方法是检测以前确定的菌株。这些被选择的菌株也有能力减少其他真菌毒素，如玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1等。了解分离微生物的解毒生理学可以增加饲料产品的商业应用。但需要考虑的重要参数包括影响菌株生长和解毒活性的外部因素，如pH、温度、需氧量、培养基和孵育时间、生物转化活性的稳定性和效率以及解毒代谢物的安全性。如呕吐毒素解毒细菌IDAC 180507-1（未知的芽孢杆菌株）可以在4～10的pH范围内生长（最佳pH为6～8），温度范围为15～55℃（最佳温度为37～42℃）（Zhou等，2014）。在最佳温度和好氧培养环境下，72h内，该菌株在玉米粉缓冲液培养基中显示出显著的细胞生长和呕吐毒素向3-呕吐毒素的生物转化（Zhou和He，2012）。Schatzmayr等（2012）报道了伏马毒素解毒菌株具有快速解毒和在复杂介质中保持生物转化能力的优点。菌株DSM 16254和DSM 16257在有氧条件下，25℃孵育1 h后，伏马毒素（2 mg/L）的解毒率为100%。在相同条件下培养5 h后，菌株DSM 16254对浓度为2～500 mg/L的伏马毒素具有降解能力。当使用复合培养基时，尽管培养时间延长至72 h，菌株在初始伏马毒素浓度为10和100 mg/L时仍表现出100%的解毒能力。

2.3.2 分解代谢酶的作用 正如前面几节指出的，在过去30年中，许多消除真菌毒素相关副作用的生物学方法被广泛使用，但最终目标是分离出能生物降解这些污染物的高效酶。酶是很有吸引力的目标，因为它们可以以一种高度专一和高效的方式加速化学反应。近年来，随着重组DNA技术和蛋白质工程的发展，酶已成为重要的催化载体，可广泛应用于不同的工业领域。微生物酶因其稳定性好、易于生产和修饰、产量高和经济可行而受人们的青睐。

在过去的二十年中，探索和鉴定真菌毒素降解菌的基因/蛋白质组构成已成为一种非常有吸引力的方法，可以用来鉴定参与生物转化的新型酶/基因，特别是在下一代测序技术、活性筛选和分子克隆技术取得进展的情况下，探索真菌毒素降解酶的兴趣似乎呈指数级增长。尽管在工业应用中分离支原体降解酶的公共利益日益增长，但实际识别酶/基因的数量仍然滞后。最近报道了一种黄曲霉毒素解毒酶（Yao等，2010），该酶是由腹腔巨噬细胞蜜环菌总RNA制备而成的，该酶的等电点为5.～-6.8，分子质量为73～77 kDa，含有695个氨基酸。重组解毒酶能解毒黄曲霉毒素B1，显著降低该毒素的诱变作用。玉米赤霉烯酮可以被漆酶降解，漆酶是一种含铜氧化酶，在工业上广泛应用，因此，在这方面具有很大的潜力。在植物应用方面，Karlovsky等（2004）报道了一种新的用于玉米淀粉解毒的多肽，它可以与一种外源启动子融合，产生一种稳定转化的转基因植物。如前所述，已鉴定的酶的数量仍然有限。解毒酶的分离成功率低的原因似乎与这一过程的复杂性有关。

3 研究展望

人们对绿色技术的接受程度越来越高，在这种背景下进行技术投资在经济上是可行的，在科学上也有回报。酶工程技术可以增强活性，或改变特异性或稳定性。酶的定向进化具有无可比拟的潜力，以改进最初的设计和产生具有最高加工特性的生物催化剂（耐极端温度、pH等），这些工具的效率只会不断提高。最后，加强政府机构之间的合作，大学和私营生物技术公司之间的合作，加快新的生物脱毒剂（微生物和酶）的鉴定和批准过程。