做好窗口期应激管理来降低复产ASF感染风险

杨有福，李 想，谭 辉，毕小娟，刘自逵1,*

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；2湖南加农正和生物技术有限公司，湖南 长沙 410329；3.PSY应用研究院，湖南 长沙 410329）

非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）感染引起的，以家猪和野猪为主要宿主的高接触性传染、病毒出血性疾病。从2018年8月份传入国内以来，官方渠道报道近200起，造成国内生猪存栏和猪肉供应“断崖式”下降。为弥补生猪存栏和猪肉供应的巨大缺口，做好ASF防控前提下的安全复产成为政府和行业的共识并积极落地。

笔者结合非洲猪瘟发病机理研究进展和多起ASF案例的防控经验和教训，总结出在猪场安全复产过程中确实存在ASF感染风险激增的节点，包括免疫、发情、配种、分娩、断奶和转群等六大风险窗口期，是猪发生应激最多、应激反应最强烈的阶段。例如，疫苗免疫特别是肌注疫苗操作对机体的应激最大，会引发窘迫应激、驱赶应激、挣扎应激、痛疼应激和感染应激等；发情、配种是机体激素变化最大的阶段，发情时会表现体温升高、采食量下降、呆立反应、异物反应、排斥反应等应激；分娩是一个极度疲劳、剧烈痛疼和代谢紊乱的过程，是母仔的生死关，其应激反应可想而知；断奶与转群对于仔猪的应激特别大，生理应激（从吃奶向吃料转化，从液体奶水向固体饲料转变）、环境窘迫（陌生环境、冷热应激、空间应激）与心理应激（陌生个体、远离母亲、打斗与惊恐）等。深挖其中的机理，我们认为六大风险窗口期造成的猪群应激会引发一系列的生理生化反应，对猪的健康极为不利，往往成为ASF感染风险升高的主要窗口期。文章旨在通过阐述各种应激对猪健康伤害与ASFV感染之间的紧密关系，为复产过程中风险窗口期的应激管控提供理论支持，为猪场安全复产提供行动思路。

1 应激反应的中心是“胃肠道”，直接损坏其黏膜免疫屏障，提高了ASFV的感染风险

猪呼吸道和消化道是ASFV感染猪的主要门户，ASFV通过扁桃体或背侧咽黏膜进入颌下淋巴结或咽后内侧淋巴结，以受体介导的“细胞内吞”为主要方式进入靶细胞，在淋巴结复制后通过淋巴液、血液快速扩散至全身[1-4]。

黏膜免疫是猪抵抗ASFV感染的第一道屏障。黏膜免疫系统是机体免疫系统重要的组成部分，包括呼吸道、消化道、泌尿生殖道的黏膜组织，由覆盖于黏膜系统内表面的黏膜上皮组织、黏膜相关淋巴组织、免疫细胞及其产生的分泌物，以及黏膜正常栖息的微生物构成，是机体与外界抗原直接接触的门户，不同部位黏膜免疫反应相关联形成共同黏膜免疫屏障（CMIS），对机体的免疫应答具有重要的调节作用[5]。SIgA作用于黏膜局部，是黏膜中关键因子，对维护黏膜上皮细胞之间的紧密连接，对由于食物摄入或由空气吸入的某些抗原物质具有封闭作用；SIgA与病毒结合，可阻挡病毒黏附于宿主细胞、中和病毒和病毒产生的毒素，增加黏液蛋白酶对抗原降解等免疫清除作用，避免抗原进入机体，从而避免有某些超敏反应发生。SIgA超高产量、超高免疫清除率，超出了其他所有Ig，能有效防御疾病、维持内环境稳定和防止某些超敏反应与自身免疫病发生。

持续而强烈地应激导致ASFV通过鼻、口侵入呼吸道和消化道黏膜，引发黏膜炎症，使SIgA由SC介导转运到消化道、呼吸道和泌尿生殖道能力下降，造成CMIS受损。应激在胃肠道黏膜上表现最为典型，有以下表现。1）交感-肾上腺髓质系统的强烈兴奋，引发内脏血管的持续性收缩，导致黏膜缺血、缺氧性损伤、溃疡与糜烂；2）通过分泌糖皮质激素（GC），抑制黏膜上皮细胞再生；3）通过调节代谢水平，导致细胞内酸性产物增多，细胞酸中毒造成损伤；4）导致氧自由基增多，破坏细胞生物膜通透性。

通过这几个机理，持续的强烈应激能破坏机体重要黏膜免疫屏障，为病毒感染打开了大门。因此，完整的黏膜免疫屏障对提高感染阈值具有十分重要的意义，维护消化道和呼吸道完整有利于防控ASF。

2 应激提高巨噬细胞CD163表达，促进ASFV感染靶细胞

2.1 CD163是巨噬细胞特异性表达蛋白，可能是ASFV感染的必要不充分条件

ASFV有严格的靶细胞趋向性，首要靶细胞是单核细胞和巨噬细胞，也有报道能感染树突状细胞[6]。这种细胞趋向性表明ASFV的感染可能需要特定的细胞表面蛋白协助。研究发现，成熟细胞更易受到ASFV的感染，而骨髓细胞和新生的血液单核细胞不易受到感染。通过FACS方法对单核细胞进行分析，发现感染的细胞有更多的成熟表型、有高水平表达几种巨噬细胞特异性标记以及SLA II抗原[7]。高度成熟的、细胞高水平表达特定标记的巨噬细胞最容易感染ASFV，尤其表达了受体CD163、表面抗原4E9（猪CD107a或溶酶体相关的膜蛋白I）的巨噬细胞更是如此[8]。

ASFV主要通过受体介导的细胞内吞方式进入细胞，然而目前可确信地参与病毒入侵的细胞受体尚不明确[3，9]。CD163是一种巨噬细胞特异性表达的蛋白，其表达的上调是巨噬细胞转变为活性表型的重要改变之一。CD163是一种血红蛋白清道夫受体，在溶血过程中能摄取释放在血浆中的血红蛋白，并与触珠蛋白络合[10]。研究发现，CD163表达的提高、单核细胞成熟度也相应提高，而ASFA感染的百分比也上升。体内的试验也同样表现出CD163的表达与病毒感染之间的紧密相关性[7]。CD163在红髓巨噬细胞、骨髓巨噬细胞、肝巨噬细胞、肺巨噬细胞等高度表达[10]，也是ASFV首选的靶细胞。因此，CD163可能是ASFV的感染受体。也有研究表明，利用基因敲除技术敲除巨噬细胞上的CD163获得的试验猪能感染格鲁吉亚2007/1毒株（Georgia 2007/1）并表现临床病症，与野生型对照组相比并没有显著差异；体外感染巨噬细胞试验也得到了同样的结果。因此，CD163并不是格鲁吉亚2007/1毒株感染的必需受体，其与其他毒株的感染能力差异仍需要进一步研究[11]。然而，通过CD163抗体处理后确实能抑制ASFV对巨噬细胞的绑定。综合这些研究结果，证明了CD163是ASFV感染的必要不充分条件，ASFV的感染可能还涉及到其他巨噬细胞表面蛋白[12]。

2.2 应激提高CD163分泌，可能是促进ASFV感染的机制之一

机体应激系统包括中枢神经系统中的下丘脑和脑干部位，以及外周的下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴、传出交感/肾上腺髓质系统和副交感系统。应激系统激活的中枢系统反应是应激性刺激激活下丘脑释放促肾上腺素释放因子（CRF），CRF可刺激B细胞增生、激活NK细胞以及增加IL-1、IL-2和IL-6等作用，同时能刺激应激系统外周活性物质GC的分泌。GC为体内重要的抗炎物质，能抑制多种促炎介质的产生，应激发生时会引发多种炎症，其分泌上升[13,14]。体外试验结果表明，GC、IL-6和血红蛋白（Hb）等能刺激CD163的表达，而IFN-γ、IL-4等能抑制CD163的表达。体内试验也证明，GC能提高CD163的表达[10]，这可能是应激促进ASFV的感染的机制之一。

3 应激诱导血管内粒细胞凝聚，加速了微血栓的形成与内皮细胞损伤，有利于病毒扩散

在细胞培养中，红细胞会形成一个皇冠状结构围绕在感染细胞周围。在感染猪体内也可以观察到梨形的红细胞吸附在感染的巨噬细胞周围，说明血细胞吸附是ASFV感染的一个特点。吸附是病毒发生感染的前提条件，ASFV在感染血细胞中粒细胞后，会诱导粒细胞凝聚，这可能是因为ASFV诱导粒细胞分泌IL-1和TNF-α，两者作为中性粒细胞的趋化因子，导致了中性粒细胞的凝聚，这在急性ASFV传播方面发挥一定作用，同时导致微血栓的形成和内皮细胞受损[16]。血细胞吸附、病毒出芽和病毒颗粒吸附红细胞存在紧密联系[15]。

应激可引发机体炎症响应。应激性刺激可激活下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴，促炎症因子IL-1和TNF-α受诱导分泌增多[13，14]。研究表明，产前分娩应激提高IL-1β和TNF-α的表达[17]，这可能与多胎妊娠动物子宫过度延展引起的机械应激随后诱导的炎症有关[18]。仔猪断奶应激除了影响采食和营养吸收能力外，体内还会蓄积大量的氧自由基。过量的氧自由基能诱导炎症细胞因子的表达，引起胃肠的炎症响应。研究发现，与哺乳期仔猪相比，断奶仔猪的空肠促炎症因子IL-1β和IL-6表达显著上升，通过饲喂抗氧化物质，断奶仔猪的促炎症因子显著降低，与哺乳期仔猪无显著差异[19]。

因此，妊娠后期饲养、分娩与断奶管理等是养猪生产中的关键节点，此时的应激极有可能导致后续的炎症反应和炎症因子的分泌，促进ASFV的早期感染与扩散。

4 应激抑制干扰素分泌，帮助ASFV实现免疫逃逸

4.1 ASFV抑制IFN分泌实现免疫逃逸

IFN是抗病毒免疫最重要的早期免疫分子，其中Ⅰ型干扰素（IFN-α、IFN-β）由感染局部的上皮细胞、成纤维细胞和pDC细胞等分泌，而Ⅱ型干扰素（IFN-γ）早期由活化的巨噬细胞和NK细胞分泌，后期由活化的辅助细胞产生。病毒感染时机体产生IFN-α和IFN-β，两者通过作用于病毒感染细胞和其临近的未感染细胞，诱导抗病毒蛋白的产生而发挥抗病毒作用。

Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素都能激活NK细胞，促进其杀伤病毒感染细胞。NK细胞是重要的早期抗病毒效应细胞，同时NK细胞还是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）中的效应细胞，通过与感染细胞结合，释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质杀伤病毒感染的靶细胞。

干扰素还能激活单核/巨噬细胞系统，增强其吞噬和杀伤功能，在病毒感染早期发挥重要的抗病毒效应。巨噬细胞在IFN-γ刺激下活化，同时促进巨噬细胞产生ROIs和RNIs，帮助杀灭被吞噬的病毒。此外，巨噬细胞也可通过ADCC机制清除病毒。

ASFV通过多种途径实现免疫逃避，包括细胞趋向性、抑制干扰素分泌、抑制干扰素响应以及抑制感染细胞的凋亡。而抑制干扰素分泌是其中最重要的免疫逃避机制。

为了能够顺利地完成病毒复制和传播，ASFV通过多种机制抑制感染细胞凋亡。但同时，ASFV也能诱导邻近的未感染的淋巴组织以及血液B细胞和T细胞大量死亡，从而达到抑制干扰素分泌、抑制免疫响应的目的。其中的机制不明，推测可能是感染的细胞分泌或传递表面因子，导致邻近未感染淋巴细胞凋亡[6]。体外培养的感染细胞中，TNF mRNA表达上升，培养液上清液有高水平的TNF蛋白，这些上清液能引起未感染的淋巴细胞的凋亡；在ASFV感染的猪体内，血清中TNF和IL-1β水平上升，巨噬细胞表达TNF-a、IL-1和IL-6，靠近的淋巴细胞同样有凋亡现象[20]。

此外，ASFV能编码多种基因抑制干扰素分泌和干扰素诱导。敲除MGF360和MGF530/505多基因家族中的一个或多个成员能显著提高对Ⅰ型干扰素的诱导和Ⅰ型干扰素诱导的下游基因的表达[6,8,21]，表明这两个基因家族是在抑制干扰素分泌和干扰素诱导中扮演至关重要的角色。例如MGF505-7R通过抑制干扰素调控因子IRF3R和NF-kB信号通路转导，抑制Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素表达；MGF360-15R（A276R）通过TLR3和胞质传感通路抑制Ⅰ型干扰素；ASFV pI329L蛋白与细胞内的TLR3相似，它是一种糖基化蛋白分泌在细胞膜上，通过竞争抑制TLR3调控的IFN-β的诱导[6]。

因此，在早期感染阶段ASFV通过诱导未感染免疫细胞凋亡、抑制干扰素分泌和抑制干扰素响应等方式，造成对免疫系统的抑制，实现免疫逃逸，保障病毒的顺利复制和扩散。

4.2 应激导致免疫抑制有利于ASFV实现免疫逃逸

短暂的急性应激能导致免疫反应增强，如外周血巨噬细胞数目增多，但高度成熟、分泌高水平CD163的巨噬细胞反而成了感染靶细胞。同时，持续的应激可抑制免疫功能。一方面应激时的内分泌调节会抑制免疫系统，如GC对免疫功能有抑制作用；另一方面，应激造成的氧自由基、促炎症因子增多，会直接损伤免疫细胞，导致免疫细胞数量下降、干扰素分泌不足，导致免疫抑制。应激造成的免疫抑制为ASFV的早期感染提供了安全的环境[22]。

总之，在发情、配种、分娩、断奶、转群和免疫这六大窗口期非常容易出现程度不同的应激以及应激性反应，引发消化道与呼吸道的共同黏膜免疫屏障的损伤、溃疡或糜烂，促进巨噬细胞表达特异性细胞表面蛋白CD163与炎症趋化因子（IL-1、TNF-α、IL-6）表达，诱导血管内粒细胞凝聚及微血栓形成与内皮细胞损伤，抑制干扰素分泌、抑制免疫反应等方式，成为ASF防控的风险“激增期”，为ASFV的入侵、成功感染和早期复制提供有利的环境，这极大增加了猪场ASF的防控风险。因此，做好猪群应激管理、做好六大窗口期风险管控是减少猪场感染风险、成功复产的关键措施。