超声微泡在乳腺癌基因治疗中的研究进展

赖晓舒，徐金锋（通讯作者）

（暨南大学第二临床医学院< 深圳市人民医院> 超声科 广东 深圳 518020）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势，严重危害了女性的生命健康。目前乳腺癌的治疗已取得较大进展，随着分子生物学及基因组学的不断发展，基因治疗成为乳腺癌治疗研究的一个重要组成部分。基因运输载体的选择很大程度上影响了基因治疗的效果，病毒载体虽然转染率高，但由于其潜在毒性、免疫反应、致突变及致癌性等缺点，限制了这类载体的临床应用，而非病毒载体转染效率常低于病毒载体。因此，如何制备出安全、高效的基因运输载体成为基因治疗研究的新方向[1]。近年来，超声微泡造影剂作为一种新型的非病毒载体受到了广泛关注，因其具有制备简单、基因转染率高、无免疫原性等优点，在肿瘤基因治疗方面具有良好的应用前景。本文综合近年来国内外对超声微泡的研究，就其在乳腺癌基因治疗方面的应用进行综述。

1 携载基因超声微泡的制备

将超声微泡应用于基因治疗的首要任务是成功制备出携载基因的超声微泡。目前微泡与基因结合的方法主要有以下两种：一是在微泡制备过程中将基因与膜壳材料混合，将基因装载在微泡的膜壳上，二是将基因结合在微泡的膜壳表面。基因可以通过静电吸附的方式连接在微泡的表面，因此，由阳离子脂质或者阳离子聚合物为膜壳材料制备的微泡更适合与带负电的基因结合用于基因治疗。大量研究也表明[2-3]，与中性微泡相比，阳离子微泡可以明显增加基因携载量及提高基因转染效率。

2 超声微泡在乳腺癌基因治疗中的应用研究

基因治疗是将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗的目的。决定基因治疗能否成功的关键是如何将基因安全、有效地导入靶组织或细胞，并促进其表达。目前超声微泡应用于基因治疗主要是通过超声靶向微泡破坏（ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD）技术来实现。UTMD 的作用机制是利用超声辐照将携载外源性基因的微泡在靶组织或器官内击破，从而将外源性基因释放出来，同时微泡爆破时产生的空化效应能使细胞膜通透性增加，促进基因进入细胞内实现转染。目前超声微泡造影剂介导基因治疗乳腺癌的常用方法有以下几种。

2.1 自杀基因疗法

自杀基因疗法，又称为基因导向性酶前体药物治疗或药物的前体激活基因治疗，是将某些病毒或细菌的基因导入肿瘤细胞中，其表达的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒性物质，从而起到杀伤肿瘤细胞的作用[4]。目前应用最广泛的自杀基因系统为HSV-TK/GCV 和CD/5-Fc。Li 等[5]成功构建了pEGFP-KDRP-CD/TK 重组质粒，并运用UTMD 联合SonoVue 微泡介导双自杀基因HSV-TK/GCV 与CD/5-Fc 在乳腺癌MCF-7 细胞中转染表达，研究发现KDR启动子可以驱动双自杀基因在MCF-7 细胞特异性表达，协同杀伤肿瘤细胞。

2.2 抗肿瘤新生血管形成疗法

肿瘤新生血管的生成是恶性肿瘤生长、侵袭和转移的基础，肿瘤的快速生长需要通过新生血管获得营养支持。目前抗肿瘤新生血管形成治疗已成为恶性肿瘤综合治疗中的一种重要方法。大量研究表明通过抑制促进肿瘤血管生成相关的生长因子（如VEGF），可以抑制肿瘤的生长。Xu[6]等制备了携VEGF-C siRNA 的超声微泡，并在超声介导下转染乳腺癌MCF-7 细胞，结果发现VEGF-C siRNA 能有效抑制MCF-7 细胞中VEGF-C 蛋白和mRNA 的表达，从而抑制了肿瘤细胞的生长。体内实验研究显示，经超声和携VEGF-C siRNA 微泡治疗后，裸鼠MCF-7 肿瘤的体积和重量明显减小。说明VEGF-C siRNA 结合超声介导的微泡破坏技术是一种有应用前景的乳腺癌基因治疗方法。

内皮抑素是目前作用最强、最特异的肿瘤血管生成抑制剂，其主要作用机制为抑制新生血管内皮细胞的增殖，并诱导其凋亡。但由于内皮抑素极不稳定且半衰期较短，因此抗肿瘤治疗时需要长期反复用药，治疗成本较高，使其在临床应用中受到很大限制。如果采用基因治疗方式，将内皮抑素基因导入体内，使其在体内长期、大量表达，就能获得充足的内皮抑素，产生持续的抗肿瘤作用。Zhou等[7]研究了携载内皮抑素质粒的CD105 靶向阳离子微泡在超声介导下进行体内外基因转染，发现其可明显抑制体外血管成型，以及延缓乳腺癌移植瘤的生长。

2.3 基因替代疗法

主要是将缺失的抑癌基因转染到肿瘤细胞内，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。P53 基因是一个重要的抑癌基因，其在调控细胞周期和诱导细胞凋亡上起着关键性作用。Guo 等[8]在超声引导下瘤内注射超声造影剂联合p53 基因治疗乳腺癌，发现能够提高p53 的表达，从而抑制肿瘤增长。

2.4 RNA 干扰（RNAi）疗法

RNA 干扰（RNAi）技术是具有同源性的双链RNA 触发的一种转录后基因沉默现象，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能，具有高度特异性和有效性。但由于siRNA 稳定性差、细胞摄取率低等问题限制了RNAi 技术的应用，如果在超声辐照下联合超声微泡可提高双链RNA 在体内运输的安全性及细胞摄取率，从而增强基因治疗效果。Zhao 等[9]制备了携载FOXA1-siRNA 和卟啉的超声微泡造影剂，通过UTMD 技术实现基因和光动力联合治疗雌激素依赖性ER+乳腺癌，研究发现低频超声联合超声微泡可以促进卟啉的摄取和siRNA 的转染，对乳腺癌具有良好的治疗效果。而且与单独使用光动力疗法或基因疗法相比，两种方法联合使用能更有效地抑制ER+乳腺癌，具有良好的协同作用。

3 总结与展望

近二十年来，超声造影剂的制备越来越受到人们的关注，已经成为医学影像领域的重点研究内容之一。超声微泡造影剂不仅用于多种疾病诊断，也作为药物及基因载体用于抗肿瘤、溶栓、抗炎等治疗，并取得了一定成功。目前超声微泡作为一种新型的非病毒基因载体，在乳腺癌的基因治疗中显示出了广阔的应用前景。但是这些研究仍限于实验阶段，应用于临床尚需要解决安全性、可操作性、医疗成本较高等许多问题。我们相信，随着医学技术的不断进步，超声微泡造影剂将在乳腺癌等恶性肿瘤的基因治疗中发挥更大的作用,有望成为一种新型的临床治疗方法。