青霉素V钾相关物质的研究

2020-12-16宋海英张小双张现华吕永健

广州化工 2020年23期

宋海英，张小双，张现华，吕永健

(河北华北制药华恒药业有限公司，河北石家庄 051500)

青霉素V钾属于β-内酰胺类抗生素，分子结构主要由β-内酰胺环和四氢噻唑环组成，其抗菌谱与青霉素G相似[1-2]，能够破坏细菌细胞壁，具有杀菌作用，是治疗革兰阳性菌及部分阴性菌感染的首选药物[3-4]。在青霉素V钾的工业生产中，由于降解反应，会产生一系列的降解产物。在提取过程中，一些杂质如果有效控制与去除，就不会带入青霉素V钾成品中，从而提高产品质量和收率[5-8]。

本论文通过高效液相色谱法(HPLC)对青霉素V钾的发酵液及提取过程中相关物质进行了跟踪检测[9-11]，摸清了各工序中相关杂质的含量分布情况，并且阐明了提取过程中相关物质的量与提取过程的关系，并追踪了成品中主要任意其他杂质的来源以及该杂质的主要影响因素分析[12-15]，为生产中有效控制主要任意其他杂质的量，减少青霉素V钾的降解损失，提高青霉素V钾成品的质量提供了依据。

1 实验

1.1 试剂与仪器

青霉素V钾(对照品)，本厂自制；苯氧乙酸(BR)，上海抚生实业有限公司；系统适用性试剂：EDQM CS；发酵液、提炼液，本厂102车间提供；磷酸二氢钾(分析纯)，天津市鼎盛鑫化工有限公司；氢氧化钠(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈(色谱纯)，天津市康科德科技有限公司；甲醇(色谱级)，美国天地；磷酸，分析纯，天津永大化学试剂有限公司；水为自制纯化水。

仪器：LC-15C高效液相色谱仪(HPLC)，岛津；色谱柱：依利特2.7 μm，4.6 mm×150 mm；DC-1506W低温恒温槽，深圳市三利化学仪器；W201恒温水浴锅，上海申顺生物科技有限公司；DW型电动搅拌器，上海鹰迪仪器设备有限公司；SHB-Ⅲ循环水真空泵，巩义市科瑞仪器有限公司；CS101-2ABN电热鼓风干燥箱，重庆永生实验仪器厂；BT100-2J蠕动泵，保定兰格恒流泵有限公司。

1.2 研究对象

青霉素V(PCV)易发生一系列降解反应。这些反应包括水解、脱羧、胺的亲核攻击、聚合和碳水化合物青霉噻唑酯的形成等。已知的相关杂质有：发酵产物A(青霉素)，加入的前体物质B(苯氧乙酸)，降解产物C(6-氨基青霉烷酸)，青霉素V的氧化产物D(4-OH青霉素V)，青霉素V噻唑酸E(两个异构体)以及青霉素V脱羧噻唑酸F(两个异构体),结构图详见文献[11]图1。

1.3 青霉素V钾溶液的制备

取青霉素酸晶160 g加入1000 mL三口瓶中，加入500 mL丁醇，打开搅拌，用蠕动泵滴加15%碳酸钾溶液，调溶液至所需pH值。将不同终点pH的成盐溶液倒入结晶装置中，真空共沸结晶至终点水分达到1.0%以下，停止加热。

1.4 检测方法

采用欧洲药典EP9.0液相色谱法检测青霉素V钾，详见《欧洲药典EP9.0》P3315-3316。

2 结果与讨论

2.1 提炼各工序中相关杂质的检测

根据提炼的工艺流程，用HPLC分析方法检测各歩过程，考察提炼过程中青霉素V钾相关物质的变化情况，先后对发酵液、乙酸丁酯的反相(RB)、酸晶、PCV钾浓液、母液五个工序的物料进行分析测定，结果见表1。

表1 提炼过程中PCV及其相关物质含量表

发酵过程中会发生氧化、水解等副反应，发酵液中已知杂质以青霉素噻唑酸为主，其次是未反应的苯氧乙酸和氧化产物4-羟基青霉素V钾；从滤液到RB，经过酸化、脱色、反萃，由于PCV比较耐酸，反萃的碱化过程是在有机相中进行，脱色BA浓度较低，因而没有新的降解杂质产生，青霉素噻唑酸部分去除，苯氧乙酸和4-羟基青霉素V钾没有变化；从RB到酸晶，经过酸化处理，没有新的杂质产生，苯氧乙酸和青霉素噻唑酸大量去除，4-羟基青霉素V钾少量残留；从酸晶到PCV钾浓液，经过碱化处理，而且在很浓的状态下，有新的任意其他杂质产生(称为杂质1，如图1所示)，苯氧乙酸略有减少，青霉素噻唑酸有所增加，4-羟基青霉素V钾变化不明显；成品中主要已知杂质为4-羟基青霉素V钾，还有少量任意其他杂质(杂质1)；PCV共沸结晶后母液中主要杂质为杂质1，其次为青霉素噻唑酸，说明杂质1在青霉素V酸加碱成盐过程中产生，在共沸结晶过程中增大。

图1 PCV成盐溶液HPLC谱图

2.2 任意其他杂质的影响因素考察

针对青霉素V酸制备青霉素V钾溶液过程中产生的任意其他杂质(杂质1)，对其产生的条件及影响因素进行了考察。

2.2.1 成盐溶液pH值对杂质1的影响

相同实验条件下，控制PVC成盐溶液终点pH值分别为6.2，6.5，6.8，7.0，7.2，考察不同终点pH对成盐溶液中杂质1的影响，结果如图2所示。从图2可以看出，成盐溶液中杂质1随终点pH值升高而明显增大，说明该杂质对碱敏感，在碱性条件下青霉素V钾降解严重。因此，为了有效控制该杂质的含量，青霉素V钾溶液成盐过程中pH控制在6.5～6.8为宜。

图2 PVC成盐溶液终点pH对溶液中杂质1的影响

2.2.2 成盐溶液浓度对杂质1的影响

相同实验条件下，将相同量的青霉素V酸晶加入不同体积丁醇中，终点pH为6.70，考察青霉素V钾成盐溶液浓度分别为150000 U/mL、200000 U/mL、250000 U/mL、300000 U/mL对料液中杂质1的影响，结果如图3所示。从图3可见，随着青霉素V钾成盐溶液浓度的升高，溶液中杂质1含量明显增大，主要是由于青霉素V钾成盐溶液浓度越高，料液降解速度越快，杂质1的生成量越大。由于成盐溶液还需进行共沸结晶，浓度与含水量直接影响结晶时间，结合能耗方面综合考虑青霉素V钾成盐溶液浓度控制在300000 U/mL以内为宜。

图3 PVC成盐溶液浓度对溶液中杂质1的影响

2.2.3 加碱时间对杂质1的影响

相同实验条件下，控制不同的碳酸钾滴加时间，检测成盐溶液中相关物质，考察不同加碱时间10 min、20 min、30 min、40 min、50 min对料液杂质1的影响，结果见图4。从图4可以看出，随着加碱时间的延长任意杂质明显减小，主要是由于加碱速度快会使青霉素V钾溶液局部过碱，造成物料降解，杂质1大量生成。延长加碱时间可以有效避免局部过碱，从而有效控制杂质1的生成。青霉素V酸成盐过程中适宜的加碱时间为40 min左右。