优化鲫鱼多肽提取工艺及其抗氧化能力的研究*

董倍余，张敏娟，黄晓霞，刘润锦，吴功庆,3

(1 广东药科大学，广东 中山 528458；2 河南地矿职业学院基础部 河南 郑州 450000； 3 广东省化妆品工程技术研究中心，广东 中山 528458)

近年来，水产源活性多肽的分离和纯化技术越来越成熟，科研人员发现大量鱼类含有抗氧化活性多肽，如罗非鱼鱼皮多肽[1]、鲢鱼鱼肉[2]、沙丁鱼[3]等。鱼类富含蛋白质分子，鱼皮中的蛋白质含量更是高达70%，蛋白质酶解得到多肽，可见鱼类是生物多肽极好的来源。

除了抗氧化功能以外，多肽还具有许多的作用，例如刘思聪研究发现毛蚶多肽能抗肿瘤[4]；新吉乐发现鹿茸多肽能回复线粒体的正常功能，清除细胞内堆积的过氧化物，抑制细胞额凋亡途径，从而预防帕金森病[5]；内皮抑制素能抑制血管增生，从而起到抗肿瘤、抗类风湿病的作用，Xu等[6]根据内皮素的功能片段研制出多肽HM-3，可见多肽具有很大的开发空间。

鲫鱼是我国重要的水产品之一，养殖规模大、养殖成本低，带来了很高的经济效益。虽然我国是淡水鱼养殖大国，但是淡水鱼加工程度不够，大多都是鲜销，利润有限[7]。因此促进淡水鱼深加工，提高淡水鱼附加价值，提高经济效益，是未来的研究方面。

本文通过酶解法，探究了木瓜蛋白酶在加酶量、温度、酶解时间三个方面对鲫鱼蛋白的酶解影响，同时对比了鲫鱼多肽与抗坏血酸对羟基自由基的清除作用来研究鲫鱼多肽的抗氧化能力，发现鲫鱼多肽具有很好的抗氧化能力。

1 实 验

1.1 材料、试剂与设备

鲫鱼购于中山市市场(鲜活)，去骨取肉，用纯水清洗干净后，吸干水分，将鱼肉置于绞肉机中搅碎成肉糜，置于-4 ℃中保存备用。

试剂：木瓜蛋白酶，上海源叶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；抗坏血酸，天津市天新精细化工开发中心；无水乙醇、过硫酸钾、氢氧化钠、酒石酸钾钠、硫酸铜等均为分析纯，购于广州化学试剂厂。

主要设备：721N分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；GZX-9240MBE恒温培养箱、JA5003N千分之一天平，上海市佑科仪器仪表有限公司。

1.2 鲫鱼酶解液的制备流程

取一定量鲫鱼肉糜，按比例加入水和酶，调节pH；反应一段时间后灭酶、离心，取上清液，即为粗活性肽。

1.3 优化多肽提取工艺

1.3.1 单因素实验

鲫鱼多肽酶解过程中主要影响因素有加酶量、酶解时间、酶解温度等。为了考察各因素对多肽酶解效果的影响，以加酶量(0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%)、酶解时间(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)、酶解温度(45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃)作为考察因素，以DPPH自由基清除率作为试验指标，进行单因素实验。

1.3.2 响应面法确定最佳提取条件

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取加酶量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)三个因素，以DPPH自由基半数消除率IC50值作为指标(Y)，对鲫鱼多肽酶解工艺条件进行三因素三水平的响应面分析，确定最佳酶解条件。

1.4 分析方法

1.4.1 DPPH自由基清除率测定

参照文献[8]有改动：将2 mL样品溶液和2 mL 2 mmol/L DPPH溶液加入具塞试管中，摇匀，放置30 min，以无水乙醇为参比，测定吸光度为Ai；DPPH溶液和无水乙醇混合液的吸光度为Ac；样品和无水乙醇混合液的吸光度为Aj。测定波长517 nm。

(1)

1.4.2 ABTS自由基的清除率测定

参照文献[8]有改动：将配好备用的7 mmol/L的ABTS溶液和7.35 mmol/L的K2S2O8溶液，以ABTS溶液：K2S2O8溶液2:1的比例混合均匀。在使用前，用超纯水稀释，吸取0.70 mL，转移到50 mL容量瓶中，定容。样品加以上储备液避光反应20 min，在734 nm处测吸光度。

(2)

式中：A1为样品溶液和ABTS储备液的吸光度值，A2为仅加样品溶液不加ABTS储备液的吸光度值，A0为仅加ABTS储备液不加样品溶液的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

称取4 g鲫鱼肉糜，置于烧杯中，加入12 mL蒸馏水，再加入0.9%木瓜蛋白酶，搅匀，在起初的水平面做标记，然后分别置于45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃中酶解1 h。然后将酶解液置于100 ℃水浴15 min，将残留的酶灭活后，补水至起初做好标记的水平面，置于离心管中，4500 rpm离心15 min，取上清液，为粗活性肽。按1.4.1方法测定DPPH自由基清除效果重复3次，取平均值。温度的影响如图1所示，随着温度的升高，粗活性肽的抗氧化能力逐步上升，温度55 ℃，抗氧化能力最佳，然后开始缓慢下滑。温度太高，酶活性降低，不利于鲫鱼多肽的酶解。

图1 酶解温度对消除率的影响

同理，分别加入0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%的木瓜蛋白酶，搅匀，然后置于55 ℃中酶解1 h，研究加酶量对粗活性肽抗氧化能力的影响(见图2)。加酶量从0.3%到0.9%，清除率增加，加酶量大于0.9%，清除率反而降低。

图2 加酶量对消除率的影响

图3 酶解时间对消除率的影

固定加入0.9%木瓜蛋白酶，置于55 ℃中分别酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，研究酶解时间对DPPH自由基清除率的影响。结果如图3所示，酶解时间越久，粗活性肽的抗氧化能力越高，3 h以后，抗氧化能力下降，酶解时间过长会使水分蒸发，还会降低多肽活性。

2.2 响应面法确定最佳提取条件

结合上述单因素分析结果，以上面3个因素为自变量，以DPPH半数清除率(Y)为响应值， 具体试验设计方案和结果如表1所示。

表1 响应面实验设计与结果

采用 Design Expert 8.0.6 软件对试验数据进行回归分析，多元回归拟合分析得到IC50与各因素变量的二次方程模型为：

IC50=4.00-0.25A-0.06B+0.28C-0.75AB+0.37AC-0.24BC-0.49A2-0.46B2-1.17C2

对表1实验结果进行统计分析，得到的方差分析结果如表2所示。

表2 响应面二次模型方差分析

由表2可知，Prob>F的值小于0.05，说明该二次方程高度显著，从回归方程各项的方差分析结果还可以看出方程的失拟项较小，表明该方程对试验拟合情况好、误差小。根据所建立的数学模型进行分析，最佳的提取条件是：加酶量0.77%、酶解时间3.32 h、温度为55.95 ℃，IC50预测值为4.05 mg/mL，修正为加酶量0.80%、酶解时间3.5 h、温度为56 ℃，IC50实测值为4.06 mg/mL，说明数学模型对优化多肽提取工艺结果可靠。

图4、图5、图6直观地反映了各因素对响应值的影响。由图4～图6可知，温度对多肽消除DPPH自由基的影响最为显著，表现为曲线相对较陡；其次为加酶量，表现为曲线相对平滑；最后是酶解时间，曲线更平滑，随其数值的增加或减少，响应值变化较小。

图4 时间与加酶量的交互作用

图5 温度与加酶量的交互作用

图6 温度与时间的交互作用

2.3 酶解液抗氧化能力测定

2.3.1 DPPH自由基消除能力

由图7可知，抗坏血酸对DPPH清除能力极强，基本维持在95%左右，说明抗坏血酸的抗氧化能力极强。而鲫鱼多肽的抗氧化能力随着浓度的升高而升高，鲫鱼多肽浓度为0.2 mg/mL时，DPPH清除只有35.3%；当鲫鱼多肽浓度为1.0 mg/mL时，清除率高达83.5%，鲫鱼多肽的抗氧化能力在一定范围内与浓度成正比，且高浓度条件下抗氧化能力较强。

图7 鲫鱼多肽与VC消除DPPH自由基能力对比

2.3.2 ABTS自由基清除能力

由图8可知，两者抗氧化能力能随着浓度增大而增强，且存在在比较稳定的差距。当酶解液浓度为0.8 mg/mL时，对ABTS的清除率也达到了56.8%，说明对鲫鱼多肽ABTS也有一定清除能力，但是相比DPPH，清除率相对低一些。

图8 鲫鱼多肽与VC消除ABTS自由基能力对比

3 结 论

采用木瓜蛋白酶酶解鲫鱼的提取工艺最适条件为加酶量0.8%、酶解时间3.5 h、温度为56 ℃，在此条件下得到的IC50为4.06 mg/mL。提取工艺简单、快捷，具有可推广性。在一定条件下，鲫鱼多肽随着浓度的增大，对DPPH和ATBS的清除效率越大。通过与抗坏血酸对比发现，鲫鱼多肽对DPPH有较好的清除率，但是对ABTS清除率稍差，整体来看，鲫鱼多肽抗氧化能力较强。鲫鱼多肽可以用作食品添加剂、抗氧化剂等，为提高鲫鱼经济效益提供了科学依据。