基于网络药理学研究益智仁治疗阿尔兹海默症的物质基础与作用机制

夏 珊 李倩茹 李生茂*

1.川北医学院药学院，四川 南充 637000；2.川北医学院药物研究所，四川 南充 637000

阿尔茨海默症(Alzheimer Disease，AD)是一种严重不可逆的神经退化性疾病，主要表现为记忆力减退和认知功能障碍[1]。在我国，60岁及以上老年群体中的AD的发病率达6.3%，80岁及以上则高达30%[2]，随着我国人口老龄化的日益严重，AD的患病人数还将不断上升[3]。目前，临床治疗AD的常用药物主要有美金刚等N-甲基-D-天冬氨酸受体抑制剂以及他克林、多奈哌齐等乙酰胆碱抑制剂[4]，可在一定程度上改善或缓解患者的症状，但无法阻止AD的进程[1]，并会引起恶心、呕吐、失眠、幻觉及焦虑等不良反应[5]。因此，寻找不良反应更小、疗效更佳的药物已成为AD治疗药物的研究热点之一。

益智仁为姜科植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.干燥成熟的种仁，具有温脾止泻摄唾，暖肾固精缩尿的功效，传统中医将其用于治疗肾虚遗尿，小便频数，遗精白浊和脾寒泄泻等[8]。现代中医临床还常将益智仁用于治疗AD，如益智醒脑方[9]、健脾补肾益智方[10]、清心益智汤[11]等含有益智仁的复方，可有效改善AD患者认知功能，提高生活质量。药理研究[12-14]发现，益智仁多种溶剂提取物，以及从益智仁中的原儿茶酸、白杨素和益智酮B等化学成分 具有较好的神经保护、提高记忆力和改善认知功能障碍的作用，表现出了巨大的治疗AD的潜力。但其治疗AD的物质基础与作用机制尚不十分清楚，有待更深入的研究。

网络药理学是目前药理学研究领域的新方法，是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析的新学科[15]，其研究理念与中药多组分、多途径、多靶点协同调节的作用模式极为契合[16]。因此，本研究采用网络药理学的方法对益智仁治疗AD的物质基础和作用机制进行了研究，以期为中药益智仁临床治疗AD提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)；TCMID数据库(http://www.megabionet.org/tcmid/)；GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)；OMIM数据库(https://omim.org/)；Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)；Pubmed数据库(http://pubmed.cn)；SwissTargetPrediction数据库(http://old.swisstargetprediction.ch/)；KEGG数据库(http://www.kegg.jp)；Drug Bank数据库(https://www.drugbank.ca)；String数据库(https://string-db.org/)；Rstudio4.0.0；UltraEdit27.00.0.22；Cytoscape3.6.1。软件运行环境：Microsoft Windows10& HomeBasic操作系统。

1.2 方法

1.2.1 益智仁潜在活性成分的收集及前处理 首先通过TCMSP 和TCMID数据库中检索益智仁(Alpinia oxyphylla)获取两个数据库收录的化学成分，然后根据口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)和类药性(Druglike，DL)进行筛选，得到OB≥30%，DL≥0.18的潜在活性成分，同时查阅文献，得到两个数据库未收载的潜在活性成分。在Pubchem数据库上获取所有潜在活性成分的中英文名称，再通过TCMSP和SwissTargetPrediction数据库下载益智仁潜在活性成分靶点，最后在uniprot 数据库中将益智仁潜在活性成分的靶点信息与人类基因名称相对应。

1.2.2 AD靶点及“益智仁-AD”共同作用靶点的获取 首先在GeneCards 数据库和OMIM数据库输入关键词“Alzheimer’s Disease”获得AD相关的基因，将基因名称去重、统一后得到AD靶点，然后将AD靶点与“1.2.1”项下对应的人类基因名称进行映射得到“益智仁-AD”共同作用靶点。

1.2.3 “益智仁-潜在活性成分-相关靶点-AD”网络图的构建 删除益智仁中无对应靶点的化学成分，将数据导入到Cytoscape3.6.1，构建益智仁和潜在活性成分所对应的相关靶点及AD的网络图，其中，每个节点(node)表示益智仁、益智仁活性成分、相关靶点或AD，边代表两节点之间的关系。

1.2.4 PPI网络(益智仁-AD靶点蛋白相互作用)的构建 在String 数据库中输入“1.2.2”项下得到的“益智仁-AD”共同作用靶点的名称，选择物种(Organism)为人(Homo sapiens)，筛选结合分数>0.4的连接关系并去除孤立节点，得到PPI网络图。

1.2.5 GO功能注释和KEGG通路富集分析 在Uniprot 数据库中将“益智仁-AD”靶点名称转化成Uniprot ID，并在Bioconductor数据库工具平台下载biocLite.R、clusterProfiler.R和pathview.R包，利用Rstudio(4.0.0)软件，设置Pvalue和Qvalue值为0.05，进行“益智仁-AD”靶点的GO功能注释和KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 益智仁潜在活性成分及其对应靶点的获得 通过TCMSP和TCMID数据库搜索益智得到41个化合物，以OB≥30%和DL≥0.18 作为筛选条件，共收集到西托糖苷、谷甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇棕榈酸酯4个潜在活性成分。同时根据文献[12,17-20]调研，发现益智仁提取物中白杨素、原儿茶酸、圆柚酮、益智酮B、9-羟基-表圆柚醇和5-羟基糠醛也具有防治AD的药理活性。因此共得到10个潜在活性成分，在Pubchem数据库上获取所有潜在活性成分的中英文名称，结果见表1。再通过TCMSP和SwissTargetPrediction数据库下载益智仁潜在活性成分靶点并将该靶点在uniprot数据库中与人类基因名称相对应，得到156个对应靶点。

表1 筛选后益智仁的潜在活性化学成分

2.2 AD相关基因与益智仁-AD共同作用靶点的获取 在GeneCards和OMIM数据库中输入关键词“Alzheimer’s Disease”后分别收集到8718、384个AD相关基因。将上述基因去重、规范后得到8435个AD相关基因。将这8435个AD相关基因与“2.1”项下得到的156个益智仁潜在活性成分所对应的靶点进行映射，得到113个“益智仁-AD”的共同靶点，并通过R语言绘制venn图，结果见图1。

图1 益智仁治疗AD的靶点基因匹配情况

2.3 “益智仁-潜在活性成分-相关靶点-AD”网络图构建与分析 去除无对应靶点的β-谷甾醇棕榈酸酯以及重复靶点，将剩下的9个益智仁潜在活性成分与113个“益智仁-AD”共同靶点导入Cytoscape3.6.1软件，绘制“益智仁-潜在活性成分-相关靶点-AD”相互作用网络图。由拓扑分析得，益智仁中潜在活性成分与各个靶点的边的数量较多的是白杨素、原儿茶酸、圆柚酮和豆甾醇，分别有85、17、11和10条边，这四种成分可能是益智仁治疗AD的重要活性成分，结果见图2。

图2 “药物-成分-靶点-疾病”网络图

2.4 PPI网络图的构建 由网络拓扑分析及统计分析每个节点得知113个靶点间共有667条连接关系，找出前30个核心基因，其中连接关系较多的ALB、SRC、EGFR、PTGS2、ESR1、AR、MMP9、BCL2L1和APP可能是益智仁治疗AD的关键靶点，结果见图3、图4。

图3 益智仁治疗AD靶点蛋白互作网络图

图4 益智仁治疗AD前30个PPI核心基因

2.5 益智仁抗AD靶点GO功能注释与KEGG通路富集分析 GO获得122条生物过程，获取富集度较高的前20条，主要涉及蛋白丝氨酸激酶、裂解酶、碳氧裂解酶、蛋白络氨酸激酶等。KEGG富集分析获得58条相关的信号通路，选取前20条，主要涉及PI3K-Akt、Ras、5-羟色胺能突触、花生四烯酸代谢、NF-kappa B、氮代谢、黏着连接、前列腺癌和HIF-1等信号通路。其中，PI3K-Akt和Ras信号通路富集度较高，可能为益智仁治疗AD的关键信号通路，结果见图5、图6。

图5 益智仁治疗AD靶点GO功能富集分析柱状图

图6 益智仁治疗AD靶点KEGG富集信息气泡图

3 讨论

本研究运用网络药理学方法，首先根据OB和DL以及查阅相关文献筛选获得白杨素、原儿茶酸、圆柚酮、豆甾醇、益智酮B、9-羟基-表圆柚醇和5-羟基糠醛等10个益智仁潜在的活性成分。其中，白杨素可通过抗氧化、抗凋亡的作用改善慢性大鼠脑缺氧模型认知功能[21]。原儿茶酸可显著降低冈田软海绵酸诱导的PC12 AD细胞模型中磷酸化微管蛋白，减少细胞形态的损伤[22]。圆柚酮能提高LPS诱导的AD小鼠模型记忆和学习能力是由于降低了神经炎症反应[23]。豆甾醇可通过增强胆碱能神经传递介导的雌激素或NMDA受体激活改善东莨菪碱所致小鼠的认知障碍[24]。益智酮B可延缓H2O2诱导的SK-N-MC细胞衰老[25]。Hong,Zhao等[26]发现9-羟基-表圆柚醇可通过抑制谷氨酸诱导的Caspase-3活化以及活性氧和一氧化氮的产生，进而保护皮质神经元。5-羟基糠醛对aβ1-42诱导的AD小鼠模型的神经损伤有保护作用，抑制β-分泌酶活性，降低aβ1-42和丙二醛含量，并增加抗氧化酶活性，从而显著改善动物模型的学习活动[27]。

益智仁作用于AD的靶点主要涉及抗炎、免疫和细胞增殖分化等三个方面。其中，涉及到抗炎的靶点有前列腺素G/H合酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)和雌激素受体(Estrogen receptor，ESR1)。PTGS2可能通过抑制前列腺素E2、缓激肽、组胺、5-羟色胺(5-HT)等炎症介质的活性实现抗炎作用[28]；表达过多MMP-9可促进炎性反应的发生而导致早期动脉粥样硬化、心绞痛等心脑血管疾病[29]。涉及到免疫相关的靶点有雌激素受体(Estrogen Receptor，ESR1)和雄激素受体(Androgen Receptor，AR)，两者与T、B淋巴细胞的发育有关，从而影响免疫/炎症相关因子的表达[30]。此外，ESR1还具有抗炎作用[31]。涉及到细胞增殖分化的靶点有表皮生长因子受体erbB1(Epidermal Growth Factor Receptor erbB1，EGFR)、非受体型酪氨酸激酶SRC(Tyrosine-protein Kinase SRC，SRC)和淀粉样蛋白前体(Beta Amyloid A4 Protein，APP)，EGFR是一种可促进细胞增殖分化的肽类生长因子[32]，SRC是生长因子受体信号通路中的重要组成部分[33]，APP是神经细胞、突触、脑功能正常运作所必须的物质，可以保护神经细胞对抗毒性侵害，促进其的增殖、分化与突触的生长，调节突触传递和突触可塑性，改善空间记忆、学习与认知等功能[34]。

GO 分析结果显示，益智仁治疗AD主要涉及蛋白丝氨酸激酶、裂解酶、碳氧裂解酶、蛋白络氨酸激酶等。蛋白丝氨酸激酶和蛋白络氨酸激酶可减少神经细胞凋亡[35]，裂解酶和碳氧裂解酶可促进神经细胞增殖分化[36]，益智仁可能通过调控这些酶的活性来治疗AD；KEGG 通路富集分析结果显示，PI3K-Akt、Ras、5-羟色胺能突触、花生四烯酸代谢、NF-kappa B、氮代谢、黏着连接、前列腺癌、HIF-1等信号通路可能与益智仁治疗AD相关。其中，PI3K-Akt和Ras信号通路富集度较高，可能为益智仁治疗AD的关键通路。PI3K-Akt信号通路是调节机体内细胞存活、分化及凋亡的重要信号通路之一，在癌症、糖尿病、神经系统疾病等的发生中扮演重要角色[37]。Ras信号通路参与细胞的生长发育、增殖分化以及细胞与细胞间的功能同步和癌变等多种生理和病理过程[38]。

4 结论与展望

综上所述，益智仁主要通过抗炎、抗氧化、抗凋亡、促进神经细胞增殖分化和提高免疫力等方面治疗AD。本研究为益智仁及其有效成分治疗AD提供了一定理论依据。但本研究仅采用网络药理学的方法对益智仁治疗AD的可能物质基础及作用机制进行了分析，为更加深入的评估其临床治疗AD的潜在可能性，还需进一步进行体内外活性实验验证。同时，益智仁在中医临床上大多与其它中药配伍使用来治疗AD，各药味之间的相互作用关系也未能得到体现，需要进一步的完善。