天麻提取物抗帕金森病作用的实验研究

陈子方 沈凡艺 李江蕊 苟向薇 郭沛鑫

云南中医药大学，云南 昆明 650500

帕金森疾病(Parkinson’s Disease,PD)是一种复杂的神经退行性疾病，多发于中老年人[1]。主要病因为脑内多巴胺能神经元的变性坏死致使多巴胺的含量相对不足，目前发病机制尚不明确[2-3]。虽然在PD早期阶段有较好的对症治疗方法，但并不能逆转神经退行性病变的进程[4]。中药天麻为兰科天麻属植物天麻(GastrodiaelataBl.)的根茎，有息风定惊、平肝潜阳等功效。近年来，关于天麻抗PD的研究报道较多[5-6]，但其有效成份尚不明确。本实验通过提取天麻成分，观察天麻提取物对PD大鼠的治疗作用，以期阐明中医对于天麻善于“息风定惊”的科学内涵，明确其有效部位，为指导天麻治疗PD的临床合理用药和开发新药提供实验依据。

1 实验材料

1.1 药物 天麻提取物，由本实验室自制(制法：用摇摆式中药粉碎机将天麻打粉至粗粉，用电子称称取天麻粗粉放入圆底烧瓶，分次加入5倍量95%乙醇回流提取3次(2 h∶1 h∶1 h)。合并3次滤液，用旋转蒸发仪回收乙醇，将浓缩液加入热水转移，按照提取液：乙酸乙酯1∶1.5的比例加入乙酸乙酯萃取四次，合并下层水液，加热浓缩，然后将浓缩液转移至恒温水浴锅挥至浸膏状，放入电热恒温鼓风干燥箱中继续干燥至恒重，即得)。美多芭(批号：SH2061，由上海罗氏制药有限公司)。

1.2 动物 SD大鼠，雄性，清洁级，体重250～350 g，由四川医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：SCXK(川)2013-12。

1.3 试剂 6-羟基多巴胺(6-OHDA，批号：MKBX2602V，Aldrich公司)；阿扑吗啡(Apomorphine，批号：LKF0204，Wako公司)。其余试剂均为分析纯。

1.4 仪器 51500脑立体定位仪(Stoelting 公司)；BW-MIP906型微量注射泵(上海软隆科技有限公司)；BW-SHD908型高速颅骨钻(上海软隆科技有限公司)；cence L 500台式高速冷冻离心机(Thermo Scientific)；101-OAB烘箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；UXF30086V63冰箱(海尔公司)。

2 方法

2.1 帕金森病大鼠模型的复制 将大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射进行麻醉，俯卧位固定于脑立体定位仪上，门齿低于耳杆2.3 mm，根据Paxson《The Rat Brain》图谱，用6-OHDA行脑立体定位注射，制作PD大鼠模型。用0.2%抗坏血酸配制6-OHDA溶液(浓度：5 μg/μL)，将上述溶液分别注入右侧黑质致密部(SNc，坐标为AP=-4.8 mm,ML=-1.2 mm,DV=-8.2 mm)和中脑腹侧被盖部(VTA，坐标为AP=-4.8 mm,ML=-2.0 mm,DV=-8.0 mm)各4 μL，留针5 min，缓慢退针。伤口处涂抹硫酸庆大霉素，用人工骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合头皮。造模14 d后，腹腔注射阿扑吗啡(0.5 mg/kg)诱导大鼠向健侧转圈，选取平均旋转圈数≥7 r/min的大鼠作为造模成功大鼠[7]。

2.2 分组及给药 取PD模型复制成功的大鼠随机分为模型对照组(给予等体积蒸馏水)、美多芭组(7.8 mg/kg)、天麻提取物低剂量组(5 g生药/kg)、中剂量组(10 g生药/kg)、高剂量组(20 g生药/kg)，每组8只。于每天早上8点按上述剂量定时灌胃给药，灌胃体积为1 mL/100 g，连续灌胃给药21 d。

2.3 行为学检测

2.3.1 对阿朴吗啡所诱导的PD大鼠神经行为学障碍的影响 在给药期间，每7 d进行1次行为学检测，腹腔注射阿扑吗啡(0.5 mg/kg)诱导大鼠转圈，观察其行为学变化，记录注射5 min后30 min内各组大鼠恒定向健侧旋转的转圈数，以此评价药物对大鼠神经行为学障碍的改善作用[8]。

2.3.2 水迷宫实验[9]Morris水迷宫为直径1.2 m，高0.9 m的圆形水池，水池内壁被漆为黑色，池内水深0.5 m，水温保持在(22±2)℃，房间内光照恒定，无光线直射在水池内。池壁上以4个等距离点将水池分为4个象限，在目标象限(设为3象限)内距离池壁35 cm处放有直径为10 cm高23 cm的圆形黑色站台，站台位于水面下2 cm。池壁内侧贴有不同形状的标记物。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。采用Smart2.0 Morris水迷宫视频分析系统进行信息处理。

2.3.2.1 记忆训练期(第1～2 d) 将大鼠面朝池壁放入水中游泳60 s,第1天引导其登上平台，第2天若在60 s内动物没有登上平台则继续引导其登上平台，停留15 s后放入温暖干燥的笼子结束训练。

2.3.2.2 记忆增强期(第3～5 d) 每只动物每天早晚各1次实验，每次分别从除平台所在方位外的3个方位各放1次，每只动物放入水中的间隔时间为15 s。动物单次游泳时间为60 s，若大鼠在60 s内不能上台则引导其登上平台适应15 s后进行下1次实验。最后将大鼠擦干放入鼠笼。

2.3.2.3 空间探索实验(第6 d) 撤除平台，将大鼠从与平台相对的方位面朝池壁放入水中，让大鼠自由游泳60 s后将动物擦干放入鼠笼。观察大鼠在平台所在象限的距离百分比(PT%)和停留时间百分比(T%)，以此来评价药物对大鼠神经行为学障碍的影响(PT%和T%值越大，表明大鼠的认知记忆能力越强)。

3 结果

3.1 对阿朴吗啡所诱导的PD大鼠神经行为学障碍的影响 实验结果表明，连续给药7 d和14 d，天麻提取物各剂量组大鼠转圈数与模型对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；连续给药21 d，天麻提取物低剂量组(5 g生药/kg)、中剂量组(10 g生药/kg)和高剂量组(20 g生药/kg)有降低阿朴吗啡所诱导的PD大鼠转圈数的趋势，但与模型对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。上述结果可能与PD大鼠受损侧脑区多巴胺受体的缓慢恢复有关。结果见表1、图1。

表1 天麻提取物对阿朴吗啡所诱导的PD大鼠认知功能障碍的影响

图1 天麻提取物对阿朴吗啡所诱导的PD大鼠认知功能障碍的影响

3.2 水迷宫实验 实验结果表明，与模型对照组比较，天麻提取物高剂量组(20 g生药/kg)在水迷宫的平台象限距离百分比(PT%)和停留时间百分比(T%)明显增加，组间比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。天麻提取物低剂量组(5 g生药/kg)和中剂量组(10 g生药/kg)也能增加大鼠在水迷宫的平台象限距离百分比(PT%)和停留时间百分比(T%)，但与模型对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2、图2。

表2 天麻提取物对水迷宫的平台象限距离及时间百分比的影响

图2 天麻提取物对水迷宫平台象限PT%及T%的影响

4 讨论

PD患者常伴随着神经行为学障碍的发生，改善神经行为学障碍，使患者回归社会，是药物治疗的重要目的[10]。在本次实验里，选择了盐酸去水吗啡(APO)所诱导的PD大鼠旋转实验和水迷宫实验来评价天麻提取物抗PD的作用。首先，在APO诱发PD大鼠旋转的实验中，实验利用立体定位仪，参考大鼠的大脑立体图谱，将6-OHDA定位注射到大鼠右侧黑质致密部和中脑腹侧被盖部，破坏黑质-纹状体DA系统，使动物毁损侧多巴胺能神经元缺失、受损，导致多巴胺含量降低，表现为PD样的症状[11-12]。此时，机体在受体调节机制下，受损侧D2受体出现上调，产生超敏感现象，当给予APO激动D2受体后则产生比健侧更强的DA活性，故而表现为向健侧的旋转。给药后，药物对脑内神经元起到保护作用，受损侧脑区受体超敏现象得到改善，但此种改善是一个缓慢的过程，所以实验仅在给药21d后观察到大鼠的转圈数有下降的趋势。在Morris水迷宫实验中，大鼠在目标象限的距离百分比(PT%)和停留时间百分比(T%)数值越大，说明其空间学习记忆能力越好[13]。实验结果表明，天麻提取物高剂量(20 g生药/kg)能明显增加PD大鼠在目标象限的距离百分比(PT%)和停留时间百分比(T%)(P<0.05)。

综上，天麻提取物口服给药，能增强PD大鼠的学习记忆能力，明显改善神经行为学障碍，但其作用机制尚需进一步研究。