三丫苦叶提取物对非酒精性脂肪肝大鼠小肠脂肪代谢的影响

胡向阳 李 安 林春淑 杨 璇

中山大学附属第五医院中医科，广东 珠海 519000

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是指除过量饮酒和其他明确的损肝因素外，以肝实质细胞脂肪变性及肝小叶炎症为特征的临床病理综合征[1]。近年相关肠道菌群失调、肠道屏障结构破坏与肝病关系等研究，揭示NAFLD与“肠道菌群/肠道通透性增加-代谢性内毒素血症(Metabolic Endo-Toxemia)-炎症因子(TNF-α)-肝脏脂肪变性/损伤”的病理途径作用相关[2-3]。中医认为脂肪肝多为喜食肥甘厚味，久则脾失健运，肝脏疏泄，痰浊瘀毒积结于肝而发病。小肠主泌别清浊，笔者认为其“泌别”功能与“肠道屏障”,“清浊”与“肠道菌群内毒素”等可衷中参西通融释义。

三丫苦Melicopeptelefolia(Champ ex Benth)Hartley为芸香科(Rutaeeae)蜜茱萸属植物，又名三桠苦、三叉虎、三枝枪、三叉苦、三丫虎等，为灌木或小乔木，分布在广东、广西、海南、江西等地区及越南、泰国、马来西亚等国家[4]。三丫苦是岭南民间常用药食同源药，是广东凉茶常用药材。在越南、马来西亚三丫苦叶是一种蔬菜沙拉，在泰国三丫苦嫩叶作为蔬菜和苦味滋补品[5]。三丫苦性味苦、寒，具有清热解毒、行气止痛、燥湿止痒的功效，主治热病、咽喉肿痛、疟疾、风湿骨痛，外用治湿疹、皮炎和疮疡等，含有生物碱、黄酮、香豆素、植物甾醇等化合物，有抑菌抗炎、镇痛、调节糖脂代谢、抗氧化等作用[6-7]。调研发现，中山、珠海群众喜欢在春夏时令采集三丫苦叶，捣碎或冷泡取汁和大米粉搅拌蒸食，广泛认可它有清热解毒功效。笔者对广东三丫苦叶单方重用(30～80 g)或辨证组方使用，发现其对高脂血症、非酒精性脂肪肝、高尿酸血症等患者有临床疗效，且前期实验研究发现广东三丫苦叶水煎液对胰岛素抵抗模型大鼠作用显著[8-9]。本研究拟观察三丫苦叶提取物对NAFLD大鼠小肠脂肪代谢作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和药物 SPF级Wistar雄性大鼠48只，采购于中山大学实验动物中心，体重(140±10)g，动物合格证号2017C117，实验前进行适应性饲养1周。非诺贝特，法国RECIPHARM FONTAINE生产，商品名力平之，每粒200 mg，批号H20160369，用生理盐水溶解调整浓度50 mg/mL药液备用。配置以每克三丫苦叶加水10 mL，浸泡1 h后煎煮，过滤药液。使用FLT-U膜过滤系统过滤药液，炭吸附并过滤除炭，设置60 ℃恒温进行旋转蒸发，湿热灭菌，制备含生药10 g/mL药液，4 ℃冰箱冷藏备用。

1.2 实验试剂与仪器 高脂肪动物食料、胆酸钠、胆固醇、丙基硫氧嘧啶购于广州天马精细化工厂，胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒购于南京建成生物试剂公司，RT-PCR仪(美国ABI公司)。DY89-I型电动玻璃匀浆机(宁波新芝)，LDZ5-2 型离心机(北京医用离心机厂)，AU600型全自动生化分析仪(日本OLYMPUS株式会社)，分光光度计(上海精密科学仪器有限责任公司)。

1.3 动物分组和造模 大鼠48只采用数字随机法分为正常对照组、模型对照组、非诺贝特组、三丫苦叶提取物组，每组12只。参照文献[10]各模型组连续8周给予大鼠高脂饮食饲养，正常组给予普通饮食。第9周开始给予各实验组大鼠药物治疗，灌服剂量非诺贝特组为100 mg·kg-1d-1；灌服剂量三丫苦叶提取物组为40 g·kg-1d-1，给予对照组和模型组等体积的生理盐水，灌药时间持续8周。

1.4 实验指标检测 各组大鼠禁食不禁水6 h，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉后打开腹腔，腹主动脉取血，4 ℃，3000 rmp离心25 min分离血清。全自动生化分析仪检测TC、TG。手术获取肝脏，4 ℃生理盐水冲洗去除薄膜，称取肝湿重，采用公式：肝指数(%)=肝湿重/体重×100%计算肝指数。冰盘上剪取肝叶移入匀浆器，加入预冷的生理盐水，研磨制备浓度10%的肝组织匀浆，3500 r/min离心15min获取上清液，全自动生化分析仪测定肝组织TC、TG。RT-PCR检测小肠上皮细胞膜蛋白脂肪酸转位酶(Cluster of Differentiation 36，CD36)、肠粘膜紧密连接闭锁蛋白(Occludin)和肠粘膜紧密连接蛋白1(Zonula Occludens 1，ZO-1)的表达水平。

1.5 统计学处理 采用 SPSS20.0统计软件，多组间计量资料比较采用F检验，两两比较采用LSD-t检验，方差不齐的数据采用秩和检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各实验组血清TC、TG、肝TC、TG及肝指数比较 模型对照组与正常组比较，血清和肝TC、TG及肝指数均显著增高(P<0.01)，表明NAFLD造模成功；非诺贝特组与模型对照组比较，血清和肝组织TC、TG及肝指数均有不同程度降低(P<0.01或P<0.05)；三丫苦提取物组与模型对照组比较，血清和肝组织TC、TG及肝指数有不同程度的降低(P<0.01或P<0.05)。三丫苦提取物组与非诺贝特组比较，肝TC有增高(P<0.05)。见表1。

表1 各实验组血清TC、TG、肝TC、TG及肝指数

2.2 各实验组小肠组织CD36、Occludin和ZO-1的表达水平比较 与正常对照组比较，模型对照组小肠组织CD36显著升高(P<0.01)，Occludin和ZO-1均显著降低(P<0.01)。与模型对照组比较，非诺贝特组小肠组织Occludin和ZO-1有不同程度的升高(P<0.01或P<0.05)；三丫苦提取物组小肠组织CD36降低(P<0.01)，Occludin和ZO-1有不同程度的升高(P<0.01或P<0.05)。与非诺贝特组比较，三丫苦提取物组小肠组织CD36降低(P<0.05)。见表2。

表2 各实验组小肠组织CD36、Occludin和ZO-1的表达比较

3 讨论

NAFLD是临床常见、发病率较高疾病，多无明显症状，常在体检时发现，传统医学中无非酒精性脂肪肝的病名，归属于“肥气病”“痰浊”“积聚”等范畴，中国NAFLD 患病率自2008～2018年激增至29.2%[11]。肝与肠道(中医包括大肠、小肠)病理方面的联系早在《内经》就有论述，如“阳明司天，燥淫所胜，病本于肝；阳明在泉所胜，民病喜呕，呕有苦,善太息，心肋痛；阳明之胜……左肋胁痛……外发颓疝；阳明之复……病生肋胁……善太息，腹胀而泄，甚则入肝，惊骇筋挛，太冲绝。”说明阳明大肠的病变可影响肝，致肝的疏泄失常。《灵枢·经脉》载肝所生病可表现出“飧泄”。指出肝的疏泄失调，气机不畅可导致大肠传导失司而出现泄泻的发生[12]。大肠主津、小肠主液，西医统称肠道消化系统，肝脏的生理功能借助于大肠降泄浊气使其保持正常，而大肠的顺利降浊又依赖肝疏泄功能的正常。肠道微生物群的生态失调及其诱导的代谢产物如胆汁酸、短链脂肪酸、内源性乙醇以及胆碱相关代谢产物的失衡，炎性反应和黏膜免疫功能受损可能是 NAFLD 发生发展的重要因素[13]。

传统汤剂是中草药疗效研究的立足点，同时，传统煎熬方式需要借助新技术改进。膜分离技术使用超滤膜截留相对分子质量5×103～5×105之间，中药所含淀粉、树脂、果胶等在5×104左右，有效成分多在1000以内。膜分离方法可以分离中药有效成，滤除杂质的及淀粉、蛋白质、树脂等高分子，得到药液色泽透亮，口感相对较好，保质期延长[14]。TG吸收进入小肠后被胆盐乳化成微滴，后者在胰脂肪酶作用下水解为甘油一脂、脂肪酸等，经过小肠绒毛表面屏障进入静脉，与血浆白蛋白结合后转运至肝脏[15]。CD36主要存在于十二指肠和空肠，对于小肠上皮细胞中长链脂肪酸的吸收有重要作用[16]。肠上皮细胞间主要连接方式是紧密连接，该结构位于相邻小肠上皮细胞膜之间，Occludin、ZO-1表达可以调控其链接功能[17]。Sellmann C等研究发现脂肪肝小鼠小肠组织Occludin和ZO-1表达下降，肠黏膜上皮屏障出现功能障碍[18]。本实验发现，NAFLD模型组大鼠大鼠血清和肝组织TC、TG及肝指数显著升高，小肠组织CD36表达显著升高，Occludin和ZO-1的表达均显著降低，提示NAFLD大鼠在血清和肝血脂代谢异常同时，肠道LCFA吸收增加，肠黏膜上皮链接受损。经过8周药物治疗，两个实验药物组大鼠血清和肝TC、TG及肝指数均有不同程度的降低，两组Occludin、ZO-1表达均有不同程度的增高，其中三丫苦提取物组CD36表达降低。上述实验结果表明，三丫苦叶提取物可以降低NAFLD大鼠血脂及肝脂水平，减轻肠道血脂代谢紊乱，其机制与干预肠道CD36、Occludin和ZO-1的表达有关。