基于HS-SPME-GC-MS对云南地区雷公藤有毒蜜的分析

赵琴 莫湘桂 谭垦

（1 中国科学院西双版纳热带植物园；2 中国科学院大学）

当蜜源植物花期结束或者气候干旱导致植物蜜露分泌下降，蜜蜂会采集有毒蜜源植物花蜜或蜜露，生成含有植物源毒素的蜂蜜[1-3]。云南地区生物多样性丰富，植被覆盖率高，蜂群可以采集的蜜粉源植物种类丰富。根据文献记载，云南地区有毒蜜粉源植物主要有毛茛科、罂粟科、山茶科、瑞香科、卫矛科、蓝果树科、杜鹃花科、马钱科、茄科、马桑科、石蒜科和菊科等植物[4]。迄今，仅少数文献对我国有毒蜜源植物种类、分布、花、花期及毒性等进行系统整理归纳[4,5]，为蜜蜂放养场地选择及采取适宜预防措施提供指导，并为蜂蜜食用安全及中毒原因追溯提供科学参考。尽管蜂农对有毒蜜花期的了解可以规避掉部分有毒蜜的产生，但更多情况下蜂农主要关注蜂群放置地点的主要蜜源，所以造成每年都会有有毒蜜流入市场，对消费者的身体安全造成威胁。近些年，由于人们盲目追求野生蜂蜜，食用未经过安全检测的蜂蜜，尤其在有毒蜜源山区，误食有毒蜂蜜而中毒的事件时有发生，对有毒蜜的研究已经成为关系蜂蜜市场安全的一个重要研究内容。

国内对于有毒蜜研究的相关文献主要集中在有毒蜜源植物的种类、分布以及有毒植物的花粉鉴别[4-9]，也有部分国内外学者对有毒蜜源植物的生物碱进行了一定研究。国外关于有毒蜜的研究也主要集中于基于液相色谱法检测有毒蜜中不同的有毒生物碱以作为对有毒蜜的生物标记。例如，陈顺安[10]采用高效液相色谱（HPLC）方法，对昆明山海棠蜜的检测发现昆明山海棠蜜中存在雷公藤甲素；赵玲玲[11]采用超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS/MS）的方法，对博落回蜂蜜中的异喹啉类生物碱的定性和定量分析，测得博落回蜂蜜中主要存在4种异喹啉生物碱。

然而，上述方法所采用的液相色谱法虽然都能对有毒蜜进行确定，但实验的前处理过于复杂，过程繁琐，耗时长，使得其效率不能满足快速经济的检测需求。因此，本研究选择采用固相微萃取气相色谱质谱联用的方法HS-SPME-GC-MS，希望可以实现对有毒蜜的快速鉴定，为蜂蜜市场的安全检测提供技术支持。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

7890A-5975C气象色谱质谱联用，美国Agilent公司；HP-INNOWAX（60m×0.25mm×0.25μm df）色谱柱，美国Agilent 公司；65μmPDMS/DVB萃取头，美国Supelco公司；LE303E/02电子天平，德国Mettler Toledo公司；Milli-Q Integral 15超纯水仪，德国Merck Millipore DE公司；HWS-26电热恒温水浴锅，上海一恒公司；Vortex3000振荡器，德国Wiggens公司；15ml顶空萃取瓶，安徽赛普瑞斯玻璃机械有限公司。

1.2 样品及试剂信息

蜂蜜样本全部取自云南地区，包括石榴蜜、枇杷蜜、苕子蜜、枣花蜜、油菜蜜、咖啡蜜、疑似雷公藤的有毒蜜（姚安县、哀牢山保护区）等，且于该花花期在当地养蜂场直接采集，并将采集的样品在8℃下避光保存。

对甲酚，分析标品，上海化成工业发展有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

顶空直接进样法：准确称取2.5g蜂蜜，按照5:1的比例加入0.5ml超纯水放置于15ml顶空瓶中，然后用PTFE/硅胶隔膜紧紧地盖住瓶口，旋紧瓶盖密封待测。样品提取前在60℃加热10min，用混匀器混匀。

顶空固相微萃取法：将65μmPDMS/DVB萃取头在250℃条件下老化半小时。将经老化处理后的萃取头插入装有2.5g蜂蜜的顶空瓶，快速推出萃取纤维头，置于60℃水浴中恒温60min，使纤维头充分吸附蜂蜜的挥发性成分，进样时，在250℃条件下解吸，同时启动数据采集，2min后拔出萃取头。

1.3.2 实验条件

图1 对甲酚标品及8种蜂蜜中对甲酚色谱图

表1 哀牢山和姚安的7种有毒蜜挥发性成分汇总

固相微萃取条件：萃取温度60℃，萃取时间60min；拔针时间2min；操作模式：恒定。色谱条件：进样口温度：250℃；升温程序：初始温度50℃，保持2min，升温速率5℃/min至220℃，升温速率10℃/min 至250℃，保持11min；分流进样，载气：氦气（99.99%），恒流流速1.0ml/min，分流比5:1。质谱条件：电离方式电子轰击电离（EI+）；电子能量：70eV；离子源温度230℃，传输线温度250℃；扫描模式：全扫模式，扫描范围35～550m/z；溶剂延迟0min。

1.3.3 定性与定量分析

采用质谱数据库（NIST 08谱库）对挥发及半挥发性成分进行定性分析，并结合标准品进行定性和半定量分析。

2 雷公藤有毒蜜的GC-MS分析

本研究按照1.3.2的条件对哀牢山和大姚的7种有毒蜜样品中的挥发性成分进行分析，通过对NIST8.0图谱库检索、图谱解析，最终在2个哀牢山和5个姚安样品中解析出133个成分。通过对雷公藤有毒蜂蜜化学指纹图谱叠加图比对研究得知这7种有毒蜂蜜的共有成分为异戊醇、2-庚醇、壬醛、顺-A,A-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇、反-A,A-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇、冰醋酸、2-乙基己醇、苯甲醛、异佛尔酮、优葛缕酮、己酸、苯乙醇、辛酸、对甲酚、壬酸、正癸酸、棕榈酸这17种成分。

在表1中将有毒蜜中的挥发物种类归为醇、醛、酚、烷烃、酸、酯、醚、酮以及其他成分9类。结合相对面积可以得到在姚安采集的有毒蜜：姚安1、姚安2、姚安3中含量较多的挥发性成分是酸类、酯类和酮类；姚安4和姚安5中醇类、酸类、酯类和酮类的含量比较多；在哀牢山1和哀牢山2中醇类、酸类和酮类的含量比较多。根据统计结果得知，在有毒蜜中醇类、酸类、酯类、酮类的化合物种类比较丰富。

通过对雷公藤有毒蜜中挥发性成分的分析发现，在所检测的7种有毒蜜中都存在对甲酚，对甲酚是一种高毒物质，口服-大鼠LD50为207mg/kg。对化合物进行定性确认，分析结果显示：对甲酚标品保留时间为34.147min，定性离子107/77；在有毒蜜中的保留时间约为34.14min，在该出峰位置均发现定性离子（107/77），说明雷公藤有毒蜜中均存在化合物对甲酚。结合对云南地区石榴蜜、枇杷蜜、苕子蜜、枣花蜜、油菜蜜、咖啡蜜7种常见蜜源的对比分析发现，这种化合物仅在枣花蜜中出现过且相对含量比较少。实验中通过对甲酚标品对有毒蜜及枣花蜜中的对甲酚色谱图叠加，得到了图1。通过峰面积和浓度比值得到这8种蜂蜜中对甲酚的含量，其中有毒蜜中对甲酚的含量在0.005mg/kg～0.11mg/kg，枣花蜜中对甲酚的含量相对较少为0.02mg/kg，根据此检测结果可以将对甲酚作为鉴别有毒蜜的一个依据。此外，经过研究发现在有毒蜜中含有多种有毒成分，其中在哀牢山有毒蜜中检测到异喹啉也属于高毒物质，口服-大鼠LD50为331mg/kg。虽然目前检测结果显示这些成分含量都不是很高，但是如果经常性的食用含有此类物质的有毒蜜同样会对健康造成危害。

3 结果与讨论

本研究发现哀牢山和姚安有毒蜜中的挥发性成分存在较大差异，很可能是因为这些蜂蜜是中华蜜蜂采集自不同花型造成，在雷公藤植物周围存在一些其他花，不同采集地点周围分布的植物存在差异造成这些蜂蜜在挥发性成分上的差异。但是研究结果表明这7种有毒蜜中都存在较高含量的对甲酚，而且与云南地区7种常见单花蜜对比，仅枣花蜜中存在该成分，并且低于有毒蜜，所以认为对甲酚可以作为有毒蜜的一个标志性化合物。