组织型转谷氨酰胺酶在大鼠心肌梗死后心肌纤维化组织中的表达及意义

孙润锋，陈云，谢印军，李敏

心肌纤维化（MF）包括心肌梗死、缺血性心肌病及高血压等多种心血管相关疾病的重要病理学变化，属于心室重构过程[1,2]，其中细胞外基质的积聚为心肌纤维化的主要表现[3]。组织型转谷氨酰胺酶（tTG）对机体内的细胞外基质起到重要的修饰作用，可有效抑制细胞外基质的蛋白酶降解速率，促进机体内心肌组织发生纤维化反应，而心肌组织纤维化的具体作用机制已成为当前研究热点， tTG是参与修饰细胞外基质的重要蛋白之一[4]。纤维蛋白1（fibrillin-1）在纤维化组织中高表达，其在体外培养的成纤维细胞的细胞外基质中沉积，参与组织的纤维化过程[5]。心肌组织发生纤维化反应的主要病理学特征是机体内心肌间质的成纤维细胞快速增殖、转化以及在细胞外基质发生沉积，但tTG在心肌组织发生纤维化反应的具体机制尚不清楚。本文为研究tTG在心肌组织出现梗死后心肌纤维在该过程中扮演的角色以及临床意义进行探讨。

1 资料与方法

1.1 实验动物将30只8周龄的雄性SD大鼠体重200～250 g，（上海南方模式生物，中国）为实验对象，随机分为心肌梗死组和假手术组各12只。

1.2 试剂tTG与fibrillin-1蛋白抗体均购自美国Abcam公司，RNA提取及PCR反应试剂盒为天根生化科技有限公司，RNA抽提试剂盒购自美国赛默飞生物公司，荧光定量PCR仪（LightCycler480，美国罗氏生物），RNA反转录试剂盒（TaqMan® RNA Reverse Transcription kit）购自美国ABI生物公司，PCR引物合成（上海生工生物科技有限公司），（表1）。

表1 各引物序列信息

1.3 制模往患有心肌梗死组的大鼠体内注射体积分数为3%的戊巴比妥钠溶液麻醉处理，备皮，辅助气管插管及呼吸机。在心尖波动最明显位置行开胸处理，充分暴露心脏，将大鼠的冠状动脉（冠脉）前降支缝合和结扎，心电图出现ST段显著升高、结扎位置以下的心肌组织泛白即认定造模成功。缝合伤口并行青霉素抗感染治疗。假手术组大鼠只进行缝针处理，其他操作与心肌梗死组相同。

1.4 超声检测心功能术后4周，通过超声心动图对大鼠心脏大小、形态和相关功能进行检查，测定左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、短轴缩短率（FS）和左心室射血分数（EF）情况。

1.5 心肌组织病理学超声检测后处死大鼠，10%KCl液洗涤心脏，用多聚甲醛对心脏组织固定处理，石蜡包埋制成切片。天狼星红染色法测定心肌组织纤维化程度：将石蜡切片放入二甲苯溶液中浸泡5 min，重复2次；分别加入体积分数为100%、90%、70%的乙醇脱水处理，使用流水不断冲洗石蜡切片，持续10 min，再用双纯水清洗切片1 min，将石蜡切片放入体积分数为0.2%磷钼酸充分接触1～5 min；将石蜡切片放入含一定湿度的染色盒中，加适量体积分数为0.1%的天狼猩红苦味酸溶液对切片染色，时间90 min；充分用力甩去天狼猩红苦味酸溶液后，加纯水洗涤；分别使用体积分数为70%、95%的乙醇溶液作用30 s，体积分数为100%的乙醇溶液对切片浸泡30 s，重复2次；加入二甲苯溶液浸泡石蜡切片2 min，重复2次，最终对石蜡切片封片处理。联合光学显微镜和Image J软件探究胶原容积百分比。

1.6 荧光定量PCR检测利用试剂盒提取心肌组织的总RNA行体外反转录实验，获得cDNA产物；反应条件为：16℃孵育30 min，42℃孵育30 min，85℃加热5 min，4℃保存。将获得的cDNA进行荧光定量PCR实验，构建20 μl的反应体系，将U6作为表达检测的内参，△CT表示tTG的相对表达含量，其中△CT=CTβ-Actin-CTtTG，荧光定量PCR实验的反应条件为：95℃预变性10 min；95℃ 15 sec，60℃ 30 sec，70℃ 30 sec，循环40次。

1.7 western-blot检测各组心肌组织样本中加入合适的组织裂解液，添加蛋白变性缓冲液于100 ℃进行变性处理，持续5 min，变性后的蛋白液加入12.5% SDS-PAGE胶，90V恒定电压电泳100 min，当溴酚兰迁移出变性胶方可停止电泳，进行转膜操作。取SDS-PAGE胶放至硝酸纤维素膜上，恒流转移，待转膜操作完成后，使用3%BSA于4℃条件下过夜封闭处理，封闭结束后，通过PBS缓冲液冲洗硝酸纤维素膜，将tTG单克隆抗体以1:500的比例进行稀释，于室温条件下孵育45 min，使用PBS缓冲液洗涤硝酸纤维素膜；再加入二抗行孵育处理，加入稀释比例为1:1000的辣根过氧化物酶标记的二抗，于室温条件下孵育30 min，使用PBS缓冲液洗涤硝酸纤维素膜，向硝酸纤维素膜中添加ECL化学发光剂行发光处理，曝光3 min，对硝酸纤维素膜进行成像。通过密度扫描仪对成像后胶片的条带吸光度进行定量分析，以β-Actin作为内参照，使用其灰度值差值，定量tTG的表达情况，采用同样地方式检测Fibrillin-1的相对表达量。

1.8 统计学分析通过SPSS 21.0统计学软件分析，均数±标准差（±s）表示计量资料，两组间差异用t检验表示， P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 心电图检测结扎大鼠前降支后，心电图ST段明显抬高（Ⅱ导联），图1。

2.2 心脏超声结果的比较与假手术组鼠比较，心肌梗死组心脏LVESD和LVEDD表达水平显著增加，P＜0.05；而EF和FS表达水平明显降低，心功能损伤严重，P＜0.05（表2及图2）。

2.3 组织病理学结果的比较经天狼星红染色结果表明，与假手术组大鼠比较，心肌梗死组大鼠心肌组织出现了更为严重的纤维化程度，心肌胶原容积分数显著增加（2.4±0.25）% vs. （11.7±0.32）%，（P＜0.01），图3。

图1 结扎大鼠冠状动脉前降支前后心电图

表2 两组大鼠心功能指数比较

图2 两组大鼠心功能指数的比较

图3 两组大鼠染色结果

2.4 大鼠心肌纤维组织中tTG、Fibrillin-1在RNA水平的表达比较荧光定量PCR检测tTG与Fibrillin-1在心肌纤维化组织中的表达发现，相比于假手术组，tTG在心肌梗死组大鼠心肌纤维组织中的表达显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05）；对Fibrillin-1表达检测发现，其在心肌梗死组大鼠心肌纤维组织中的表达显著高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3及图4）。

表3 各组大鼠心肌纤维组织中tTG与Fibrillin-1在RNA水平的表达

图4 大鼠心肌纤维组织中tTG与Fibrillin-1 RNA水平表达比较

2.5 大鼠心肌纤维组织中tTG、Fibrillin-1在蛋白水平的表达比较采用western-blot检测tTG与Fibrillin-1在心肌纤维化组织中的表达发现，相比于假手术组，tTG蛋白在心肌梗死组大鼠心肌纤维组织中的表达显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05）；对Fibrillin-1蛋白的表达检测发现，其在心肌梗死组大鼠心肌纤维组织中的表达显著高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05），与定量PCR检测结果一致（表4及图5）。

表4 各组大鼠心肌纤维组织中tTG、Fibrillin-1蛋白的表达比较

图5 大鼠心肌纤维组织中tTG与Fibrillin-1蛋白水平表达比较

3 讨论

心肌梗死发生后，梗死部位的细胞出现凝固性坏死，机体内大量嗜中性粒细胞等炎症细胞浸润和侵袭心肌组织，伴随炎症修复反应的增强，梗死部位的邻近组织逐渐出现肉芽组织增生，即瘢痕愈合，最终诱发心肌组织发生重构[6-8]。心肌组织重构过程对心脏功能造成一定的影响，病情严重者可能发展成心力衰竭[8]。迄今为止，心肌组织出现纤维化是心肌组织发生重构过程的重要表现[9]。心肌组织发生纤维化反应的主要病理特点是：心肌细胞外间质中胶原蛋白分子呈现高表达水平以及大量蓄积现象，胶原蛋白合成比例紊乱、排列无序[10]。tTG作为转谷氨酰胺酶家族成员之一，对蛋白质谷氨酰胺与赖氨酸残基间的转谷氨酰胺反应具有催化作用的酶，利于胶原纤维、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质蛋白发生交联反应，利于形成稳固结构从而避免降解，tTG常被作为参与组织器官纤维化病变的关键细胞因子[11,12]。刘森炎等[13]对肾脏纤维化研究发现，tTG能够与胞外基质蛋白发生交联作用，促进组织纤维化发展；陈园园等[14]对2型糖尿病心肌纤维化大鼠研究发现，tTG在心肌纤维化中高表达，与心肌纤维化进程密切相关；但在心肌梗死后心肌纤维化组织中tTG的表达鲜有报道。

我们以心肌梗死大鼠为研究对象，心肌梗死术后4周，与假手术组大鼠相比，心肌梗死组大鼠LVESD和LVEDD 的表达水平明显增加，而EF、FS 的表达水平均显著下降。另外，心肌梗死组大鼠心脏不断增加，心室壁变薄，梗死区出现白色瘢痕组织，部分出现室壁瘤，室间隔膨出。另外，心肌梗死区出现胶原纤维沉积，提示大鼠心肌梗死模型成功构建。通过实时定量荧光PCR实验和蛋白质印记实验对心肌组织中tTG的转录和蛋白水平进行定量分析，结果显示心肌梗死组大鼠的心脏中tTG的含量显著升高，表明tTG基因表达水平过量，提示tTG参与调控心肌梗死大鼠的心肌组织发生纤维化。荧光定量PCR实验表明，心肌梗死组大鼠中心肌组织的fibrillin-1含量显著升高，与tTG的表达趋势相似，表明tTG可能联合fibrillin-1来参与心肌组织纤维化过程。

tTG在心肌组织的纤维化过程扮演着重要角色，可能联合fibrillin-1调控心肌纤维化的全程。为理解tTG在心肌梗死后心肌纤维化中的作用以及意义，提供了实验依据，或可作为心肌纤维化的治疗靶点[15]。