甘薯糖蛋白分离纯化及结构分析

2020-12-16孙昌平王贵珍

农产品加工 2020年21期

孙昌平，王贵珍

（1.长春市食品药品监督管理局汽车经济技术开发区监督管理所，吉林长春 130000；2.吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春 130000）

甘薯属旋花科，甘薯属，又称白薯、红薯、山芋、甜薯、地瓜等，在世界范围内广泛种植，是我国的主要经济作物之一，同时我国也是世界上甘薯产量最高的国家。甘薯因产量高、适应性广、抗逆性和再生能力强、营养丰富而具有医疗价值，是食品工业的一种好原料[1]。

糖蛋白（Glycoprotein）是甘薯中的一种生物活性成分，具有保持消化道、呼吸道、关节腔、膜腔的润滑和血管弹性的生物活性，同时有降血糖、抗衰老和抗癌的作用[2]。糖蛋白是一类由糖类同多肽或蛋白质以共价键连接而形成的结合蛋白[3]。其结合方式主要有2 种[4]：①糖和含羟基的氨基酸以糖苷形式结合，称为O - 连接；②糖和天冬酰胺基连接，称为N - 连接。在生物体内糖蛋白以不同的形式存在而发挥作用，是细胞膜、细胞间基质、血浆、黏液、激素等的重要构成成分，营养学家发现甘薯中含有一种独特的黏蛋白，具有抑制胆固醇在体内沉积、增强机体免疫力、减少高血压发生率、减慢人体器官老化速度等特殊生理功能[5]。科学家也指出，甘薯具有防治糖尿病、白血病等多种疾病的作用[6]。甘薯是我国四大粮食作物之一，也是食品工业、轻工业和饲料工业的重要原料，其中含有的甘薯糖蛋白（SPG）大量存在于甘薯淀粉生产的废水之中[7]，若采用适当的手段将其分离提取，将产生显著的经济效益和社会效益。

试验对甘薯水溶性糖蛋白进行了分离纯化，获得了纯度较高的甘薯水溶性糖蛋白，同时对其性质进行了研究，确定了分离糖蛋白的糖肽键类型、糖苷键的连接方式及其类型，分析了氨基酸的组成，为甘薯功能性食品的生产提供了理论依据。

1 仪器、试剂及材料

1.1 仪器

723 型可见分光光度计、FA 2004 B 型分析天平，上海精密科学仪器有限公司产品；8000 型低速离心沉淀机，常州国华仪器有限公司产品；RJ-TDL-5A 型低速台式大容量离心机，常州恒隆仪器有限公司产品；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司产品；GZX-9240 MBE 型数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司产品；R-201 型旋转蒸发仪，郑州华瑞仪器有限公司产品；恒温数显水浴锅，常州亿通分析仪器制造有限公司产品；UV-2201 型紫外- 可见分光光度计，日本岛津公司产品；Biochrom型全自动氨基酸分析仪，美国通用公司产品；红外扫描仪，常州博恒电子科技有限公司产品；77530-01 型真空冷冻干燥系统，北京松源华兴生物技术有限公司产品；FSD-70 型实验室粉碎磨，上海嘉定粮油仪器有限公司产品。

1.2 试剂

无水乙醇、丙酮、无水乙醚、氯仿、正丁醇、浓硫酸、磷酸缓冲溶液（pH 值2.2）、浓盐酸、6 mol/L盐酸、0.2 mol/L 盐酸、氢氧化钠、氯化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、无水硫酸铜、酒石酸钾钠、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、液溴、苯酚、酚酞、Tris 、盐酸羟胺、无水吡啶、乙酸酐、葡萄糖，均为分析纯。

1.3 材料

甘薯，DEAE-22（进口分装）；Sephadex G-150，北京东凯元医药生物技术研究院提供；葡萄糖标准品，天津市北方天医化学试剂厂提供；牛血清蛋白，北京奥博星生物技术责任有限公司提供。

2 试验方法

2.1 技术路线

原料预处理→切碎烘干→粉碎→浸提→有机溶剂沉淀→干燥得粗品。

2.2 甘薯糖蛋白的提取

将新鲜甘薯清洗、去皮、切块，置于60 ℃鼓风干燥箱中烘干、粉碎；精确称取30.000 g，加入450 mL蒸馏水，于60 ℃下浸提1 h，离心得上清液，反复浸提3 次。浸提液在40 ℃下真空浓缩至50 mL 后加入150 mL 无水乙醇，沉淀[8]，得到糖蛋白粗品SPG1。

2.3 甘薯糖蛋白的纯化

2.3.1 甘薯糖蛋白纯化的技术路线

Sevage 试剂除杂蛋白→透析去除游离蛋白→浓缩→DE-22 层析柱纯化→Sephadex G-150 层析柱纯化→透析、浓缩、干燥得纯品。

2.3.2 除杂蛋白

称取适量SPG1 溶解与蒸馏水中，加入4 倍体积Sevage 试剂（氯仿∶正丁醇= 4∶1）充分振荡混匀，以转速4 000 r/min 离心10 min[9]；然后将糖蛋白液体置于透析袋内于流动水中过夜透析；收集透析液，真空浓缩至50 mL 后加入3 倍体积的无水乙醇，收集沉淀，于40 ℃下真空干燥得糖蛋白粗品SPG2。

2.3.3 DEAE- 22 柱层析

称取SPG2 并溶解，上样至预先平衡好的OH- 型DEAE-22 纤维柱，分别用0.05，0.10，0.50 mol/L 的NaHCO3溶液50 mL，每管收集5 mL，逐管检测OD490nm（多糖吸收峰）和OD280nm（蛋白质吸收峰），合并同时含蛋白质和多糖的洗脱液，经透析、沉淀和干燥获得甘薯糖蛋白半纯品SPG3。

2.3.4 Sephadex G- 150 柱层析

称取甘薯糖蛋白SPG3 溶解于0.02 mol/L Tris-HCl 缓冲液溶解（pH 值7.2）并上样至预先平衡好的SephadexG-150 层析柱中，洗脱，收集洗脱液，经透析、沉淀和干燥获得甘薯糖蛋白半纯品SPG4。

2.4 甘薯糖蛋白中多糖含量的测定

以葡萄糖为标准品，制作标准曲线，用苯酚-硫酸法测定甘薯糖蛋白纯品中多糖含量。

准确称取无水葡萄糖0.010 0 g，溶解并定容至100 mL，获得质量浓度为100 μg/mL 的葡萄糖标准品溶液。取6 支刻度试管，依表1 加入试剂。

葡萄糖标准曲线加料见表1。

表1 葡萄糖标准曲线加料

充分反应后，检测490 nm 条件下吸光度，绘制标准曲线，SPG4 溶解，依次加入苯酚和硫酸，充分反应后根据标准曲线测定SPG4 中多糖含量。

2.5 甘薯糖蛋白中蛋白质含量的测定

用Folin- 酚法测定甘薯糖蛋白纯品中蛋白质含量。称取0.025 0 g 牛血清白蛋白，溶解后定容至100 mL，得质量浓度为250 μg/mL 的牛血清白蛋白溶液，取6 支刻度试管，依表2 加入试剂，配制不同质量浓度的牛血清蛋白溶液。

牛血清蛋白标准曲线制作加料见表2。

表2 牛血清蛋白标准曲线制作加料

向各试管中加入Folin - 酚甲试剂5 mL，混匀后室温下放置10 min，分别加入试剂乙0.5 mL，立即混匀，30 min 后以0 号管为对照，检测各管OD750nm，绘制标准曲线。SPG4 溶解，按标准曲线测定的方法依次加入Folin - 酚甲、乙试剂，反应完全后，测定样液吸光度，计算样品中蛋白质的含量。

2.6 氨基酸组成分析

分别取20 mg SPG2 和SPG4 于水解管中，加入6 mol/L 的盐酸溶液10 mL，抽真空，冲入氮气，封管，于110 ℃下水解22 h ，取出冷却后，定容至50 mL，过滤后取滤液1 mL 于25 mL 烧杯中，蒸干后加入磷酸缓冲溶液搅拌均匀，用氨基酸分析仪进行氨基酸分析。

2.7 红外吸收光谱分析

取15 mg SPG4 加入100 mg kBr 充分研磨后，进行压片，在400～4 000 cm-1用红外光谱扫描仪进行扫描。

3 结果与分析

3.1 糖蛋白的一般性质

糖蛋白纯品SPG4 为白色粉末，易溶于水。

3.2 DEAE-22 纤维素柱层析纯化

DEAE-22 洗脱曲线见图1。

经DEAE-22 纤维素层析柱初步纯化后得到1 个主峰，收集此高峰部分，经透析去除无机杂离子，旋转蒸发浓缩，加入无水乙醇沉淀后经冷冻干燥即得到甘薯糖蛋白半纯品SPG3。

3.3 Sephadex G-150 柱层析纯化甘薯水溶性糖蛋白结果分析

Sephadex G-150 洗脱曲线见图2。

SPG3 经Sephadex G-150 柱层析洗脱后得到2 个主峰，其中第1 个峰值高，对称性好，分离度好。故收集合并此重叠峰部分，经透析、浓缩、沉淀和干燥获得甘薯糖蛋白纯品SPG4。

3.4 甘薯糖蛋白中多糖含量测定结果

葡萄糖标准曲线见图3。

根据标准曲线测得SPG4 中蛋白含量为75.1%。

3.5 甘薯糖蛋白中蛋白含量测定结果

牛血清白蛋白标准曲线见图4。

根据标准曲线测得SPG4 中蛋白含量为23.9%。

3.6 糖蛋白的氨基酸组成分析

甘薯水溶性糖蛋白纯品酸水解液的氨基酸分析图谱如下。

SPG2 氨基酸组成分析（440 nm）见图5，SPG2氨基酸组成分析（570 nm）见图6，SPG4 氨基酸组成分析（440 nm）见图7，SPG2 氨基酸组成分析（570 nm）见图8，甘薯水溶性糖蛋白粗品和纯品中氨基酸含量见表3。

由试验结果可知，甘薯水溶性糖蛋白几乎含有人体所需的各种氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸含量较高。除色氨酸在酸水解时被破坏未被检测外，甘薯水溶性糖蛋白含有7 种必需氨基酸，表明甘薯水溶性糖蛋白是一种优质的植物蛋白质。

表3 甘薯水溶性糖蛋白粗品和纯品中氨基酸含量

3.7 甘薯水溶性糖蛋白的红外光谱分析

甘薯水溶性糖蛋白的红外光谱图见图9。

从图9 可以看出，SPG4 的特征吸收峰（cm-1）分别在3 398（-OH），2 927，2 961（-N-H），1 647，1 558（-C=O-），1 396 (-C-C-) ，1 050（-C-O-），831，702（-C=C-H）。其中，1 647，558（-C=O-）为肽链上酰胺基羰基的吸收峰，3 398（-OH），1 050（-C-O-）为多糖分子的特征吸收峰，831 cm-1附近的吸收峰表明SPG4 中含有α- 糖苷键，由1 050 cm-1附近的吸收峰可知SPG4 的糖苷键类型主要为吡喃型。