植物乳杆菌发酵苹果浆的工艺优化及其抗氧化能力

苟拥军，王 雪，刘 梁，吕鹏军，孟永宏

（1.西安市长安区气象局，陕西 西安 710100；2.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119）

苹果营养价值高，富含多种维生素和多酚等多种生物活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、预防冠心病等多种功效[1]。我国苹果年产量约4 000 万t，居全球首位[2]，但是近4 年来平均每年加工量约为生产量的20%，产品单一，多以浓缩苹果汁为主。苹果加工过程中会产生大量副产物，其综合利用水平低，不仅造成了资源浪费、效益流失，而且还污染环境，甚至影响农业可持续发展[3]。因此，发展苹果多元化加工，对调整和优化苹果产业结构、促进产业持续健康发展、满足广大消费者需求显得尤为迫切[4-5]。植物乳杆菌是从传统的植物性发酵食品中分离筛选出来的一类乳酸菌，其在食品发酵、工业乳酸发酵和医疗保健领域中具有广泛的应用[3]。目前，研究发现利用植物乳杆菌发酵果蔬，可以有效转化多酚的组成、提高其抗氧化性，从而提高生物利用度[6-7]。

近年来，许多国内外学者在利用植物乳杆菌发酵苹果开发针对蛋白敏感人群、素食主义者的乳酸菌补充剂和聚集果蔬精华与乳酸菌保健功能为一体的新型发酵制品方面进行了大量的研究[8]。李维妮等人[9]利用混菌发酵苹果汁，通过优化发酵工艺条件，得到了活菌数8.3 lg（CFU/mL），感官评分为80.23 分的苹果汁饮料。王昕悦等人[10]利用单菌或混菌短时间发酵苹果浓缩汁，获得具有独特风味、多元化的发酵苹果浓缩汁饮料。李帅等人[11]以苹果渣和复原乳为原料，优化乳酸菌发酵工艺条件后，生产出风味纯正的固体复合发酵乳饮料。Dimotrovski D 等人[12]在添加有乳清的苹果汁中进行植物乳杆菌发酵，研制出在30 d 内活菌数仍能保持为6.0 lg（CFU/mL） 的新型苹果汁饮料。目前，对乳酸菌发酵的研究主要以苹果汁为原料，而通过乳酸菌直接发酵苹果浆，可以高效利用苹果资源，解决苹果资源浪费和污染环境问题。因此，以活菌数为指标，通过响应面试验对植物乳杆菌直接发酵苹果浆的发酵条件进行优化，并分析苹果浆发酵前后多酚和抗氧化活性的变化，研究发酵对苹果浆营养强化的调控规律，从而为开发新型的健康果蔬产品提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“秦冠”苹果，购于陕西礼泉，要求大小均一、无病害或腐烂、无机械损伤；植物乳杆菌WCFS1，中国工业微生物菌种保藏中心提供；MRS 肉汤培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司提供；甲醇（色谱纯，纯度＞99.99%），美国Tedia 公司提供；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS 型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；WZS80 型手持式糖度计，上海仪电物理光学仪器有限公司产品；UV2600A 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海） 有限责任公司产品；1260 Infinity II 型液相色谱仪，美国Agilent 公司产品；3k30 型超高速低温离心机，美国Sigma 公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 植物乳杆菌发酵苹果浆的工艺

按以下工艺流程进行植物乳杆菌发酵苹果浆，并确定最佳工艺参数。

1.3.2 操作要点

（1） 护色。采用质量分数为0.25%氯化钙和0.5%抗坏血酸溶液护色之后进行打浆处理。

（2） 调糖、调酸。使用浓缩苹果汁调节苹果浆至适宜糖度，苹果浆初始pH 值为3.3 左右，用食品级氢氧化钠溶液调节苹果浆pH 值到适当值，调节过程中不断搅拌，以保证苹果浆混匀。

（3） 杀菌。锥形瓶分装苹果浆，煮沸3 min，迅速冷却至30 ℃。

（4） 接种。将冰箱保存的植物乳杆菌接种于斜面固体培养基上，温度30 ℃，时间24 h，取1 环菌种接种于100 mL 的MRS 液体培养基，于30 ℃下恒温培养24 h，离心去上清液，收集菌体。用生理盐水悬浮制成约7.0 lg（CFU/mL） 的菌悬液。以5%的接种量接种至苹果浆中，间隔8 h 取样，测定理化指标。

1.3.3 单因素试验

参照1.3.1 植物乳杆菌发酵苹果浆的工艺流程，分别选取苹果浆的初始糖度（11，12，13，14，15°Bx）、初始pH 值（3.5，4.0，4.5，5.0，5.5） 和发酵温度（28.0，30.0，32.5，35.0，37.0 ℃） 进行单因素试验，选取活菌数最大为优化的量化判断指标，探究植物乳杆菌发酵苹果浆的最适条件。其具体条件如下：

（1） 初始糖度的确定。设定植物乳杆菌接种量5%，发酵时间48 h，发酵温度32.5 ℃，初始pH 值4，初始糖度为11，12，13，14，15°Bx。

（2） 初始pH 值的确定。设定植物乳杆菌接种量5%，发酵时间48 h，发酵温度32.5 ℃，初始糖度13 °Bx，初始pH 值为3.5，4.0，4.5，5.0，5.5。

（3） 发酵温度的确定。设定植物乳杆菌接种量5%，发酵时间48 h，初始糖度13 °Bx，初始pH 值4，发酵温度为28.0，30.0，32.5，35.0，37.0 ℃。

1.3.4 响应面优化苹果浆发酵试验条件

在单因素试验结果的基础上，采用Box Behnken模型，以初始糖度（A）、初始pH 值（B） 和发酵温度（C） 为自变量；（分别以-1，0，+1 代表自变量的低、中、高3 个水平，即初始糖度13，14，15°Bx；初始pH 值3.5，4.0，4.5；发酵温度30.0，32.5，35.0 ℃），以植物乳杆菌活菌数为响应值，选择苹果浆发酵的最佳条件。

1.3.5 理化指标测定

（1） pH 值测定。采用精密pH 计测定。

（2） 可溶性固形物测定。利用手持式糖度计测定。

（3） 活菌数的测定。依据GB 4789.35—2016《乳酸菌检验》[13]的梯度稀释平板计数方法。选择2～3 个适宜稀释度，在MRS 琼脂培养基上均匀涂布，每个稀释度分别做2 个平行。将涂布完成的培养基于30 ℃恒温培养72 h 后计数。

1.3.6 苹果多酚的测定

根据齐娜等人[14]高效液相色谱法（HPLC） 测定发酵苹果浆中的多酚含量。首先对发酵苹果浆提取，然后取10 μL 进行HPLC 分析，与多酚标品进行对比分析。

（1） 游离态多酚的提取。参考王耀红等人[15]的方法。取10 mL 发酵前后的苹果浆样品，分别和甲醇以1∶3（V/V） 于锥形瓶中混匀，用保鲜膜封口，于50 ℃，360 W 的条件下超声提取40 min。抽滤后，将滤液在40 ℃下旋转蒸发去除有机溶剂，加甲醇（色谱纯） 溶液定容至10 mL 棕色容量瓶，用0.45 μm滤膜过滤得到游离多酚提取液。

（2） 结合态多酚的提取。参考史江颖等人[16]的方法。将上述充分提取游离态多酚后的残渣称取1 g，加入浓度为2 mol/L 的氢氧化钠溶液4 mL，常温超声提取1 h 后，以转速5 000 r/min 离心10 min，取上清液用浓度为6 mol/L 的盐酸溶液调节pH 值为4.0，加甲醇（色谱纯） 定容至10 mL 容量瓶，用0.45 μm 滤膜过滤即得结合态多酚提取液。

（3） 色谱条件。Welchrom-C18柱（4.6mm×150mm，5 μm），柱温30 ℃，检测器波长280 nm，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。流动相：100%甲醇溶液（A） - 0.3%冰乙酸水溶液（B）。梯度洗脱程序：0～20 min，0～20.0% A，100.0%～80.0% B；20～40 min，20.0% A，80.0% B；40～41 min，20.0%～30.0% A，80.0%～70.0% B；41～50 min，30.0% A，70.0% B；50～51 min，30.0%～35.0% A，70.0%～65.0% B；51～60 min，35.0% A，76.0% B；60～61 min，35.0%～45.0% A，65.0%～55.0% B；61～70 min，45.0% A，55.0% B；70～71 min，45.0%～55.0% A，55.0%～45.0%B；71～80 min，55.0%A，45.0%B；80～81 min，55.0%～10.0%A，45.0%～90.0%B；81～90 min，10.0%A，90.0% B。

1.3.7 苹果浆抗氧化活性测定

（1） 苹果浆对DPPH 自由基的清除作用[17]。将苹果浆以转速5 000 r/min 离心处理15 min 后，取0.1 mL 上层清液加入现配制的3.9 mL DPPH 甲醇溶液（0.025 g/L） 避光反应30 min，于波长517 nm 处测定样品吸光度A1。以甲醇为空白测定吸光度A0，平行3 次，清除率按以下公式（1） 计算：

式中：A0——空白的吸光度；

A1——样品的吸光度。

（2） 苹果浆对ABTS 自由基的清除作用[18]。取浓度为7 mmol/L 的ABTS 溶液25 mL 和浓度为140 mmol/L的过硫酸钾溶液440 μL 混匀，室温下避光反应16 h，制成ABTS 工作液。将避光16 h 后的ABTS 工作液与乙醇按1∶49（V/V） 的比例稀释。苹果浆以转速5 000 r/min 离心处理15 min 后，取上层清液0.1 mL 加入3.9 mL 处理后的ABTS 工作液，于黑暗处反应10 min，于波长734 nm 处测定样品吸光度A1。以乙醇替代样品测定吸光度A0。每个样品重复3 次。清除率按以下公式（2） 计算：

式中：A0——空白的吸光度；

A1——样品的吸光度。

1.4 数据统计分析

每个试验重复3 次，采用Origin 9.1 进行数据统计和制图，用SPSS19.0 统计软件检验分析比较各试验组间均值差异显著性（p＜0.05），用Design-Expert 8.0.6 软件进行响应面设计。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌发酵苹果浆的单因素试验

在植物乳杆菌接种量5%，发酵时间48 h 条件下，研究初始糖度、初始pH 值和发酵温度对苹果浆发酵活菌数的影响。

初始糖度（a）、初始pH 值（b）、发酵温度（c）对苹果浆发酵过程中活菌数的影响见图1。

2.1.1 发酵初始糖度的确定

糖分是微生物生长繁殖的主要能量来源，对植物乳杆菌发酵苹果浆产生重要的影响。如图1（a）所示，在不同初始糖度的发酵条件下，初始活菌数基本一致，且随着糖度的升高，活菌数逐渐提高。其中，糖度13，14，15 °Bx 的苹果浆活菌数增长速度较快，且在40 h 后变化不明显，发酵结束时，糖度为14 °Bx 的苹果浆中的活菌数最高。同时，在发酵过程中pH 值的变化不显著，基本保持在3.5～4.5。综上所述，选取发酵糖度为13，14 ，15 °Bx 作为下一步工艺优化的3 个水平。

2.1.2 发酵初始pH 值的确定

在发酵过程中，pH 值不仅是微生物生长的重要的状态参数，同时也是衡量乳酸菌发酵周期的重要指标，初始pH 值对产酸速度有着重要的影响。如图1（b） 所示，随着pH 值的升高，苹果浆乳酸发酵的活菌数逐渐上升，其中初始pH 值为3.5，4.0，4.5的苹果浆在发酵结束时的活菌数高于其他2 种条件下的苹果浆。主要原因是当微生物的适宜生长pH 值范围遭到破坏后，微生物的生长就会被抑制[19]。同时，调节苹果浆初始pH 值为3.5，4.0，4.5 时，可溶性固形物含量逐渐降低。综上所述，初始选取pH 值为3.5，4.0，4.5 作为下一步工艺优化的3 个水平。

2.1.3 发酵温度的确定

发酵温度与微生物的生长密切相关，微生物生长是一系列复杂生化反应的结果，改变发酵温度也影响体内所进行的许多生化反应，从而对生长速率产生影响。因此，研究发酵温度对植物乳杆菌的生长至关重要。如图3（c） 所示，升高温度，微生物的生长速率会提升，但是过高的温度对发酵速率并无明显的促进，其中发酵温度为32.5 ℃的苹果浆的活菌数较高，这可能是温度过低或过高会影响酶的活性，从而影响菌体生长[20]；同时，在不同发酵温度下，pH 值和可溶性固形物含量都不断下降，最终保持恒定。综上所述，选取发酵温度为30.0，32.5，35.0 ℃作为下一步工艺优化的3 个水平。

2.2 响应面优化植物乳杆菌发酵苹果浆的条件

2.2.1 响应面设计及结果

以1.3.4 中的响应面试验设计进行植物乳杆菌发酵苹果浆工艺优化。

响应面试验设计及结果见表1。

利用Design－Expert 8.0 统计软件对试验数据进行二次多项回归拟合，分别获得乳酸菌活菌（Y） 对3 个自变量初始糖度（A）、初始pH 值（B）、发酵温度（C） 的多元回归方程：

2.2.2 方差分析

对2.2.1 中的响应面试验设计中得出的回归方程进行方差分析。

方差分析结果（活菌数为响应值） 见表2。

由表2 可知，模型p＜0.01，说明试验所选用的二次多项模型差异极显著。失拟项p＞0.05（p=0.955 8），差异不显著。模型决定系数R2=0.991 7，调整相关系数R2adj=0.981 1，说明植物乳杆菌活菌数的实测值与预测值之间具有较好的拟合度。并且该模型说明初始糖度（A）、发酵温度（C）、BC 及二次项A2，B2，C2对苹果浆活菌数的影响极显著，初始pH 值（B）及AB，AC 对活菌数的影响不显著。

表1 响应面试验设计及结果

表2 方差分析结果（活菌数为响应值）

2.2.3 因素间交互作用分析

为探究初始糖度、初始pH 值和发酵温度这3 个因素之间的交互作用对苹果浆发酵的影响，对其响应面曲线及等高线图进行分析，从而确定各个因素的最佳水平。

两因素交互作用对活菌数的影响见图2。

图2 （a） 中，发酵温度固定在零水平时，活菌数随着初始糖度的升高而增加，达到最大值后呈下降趋势，随着初始pH 值的升高先增加，随后呈下降趋势，坡度较缓，同时等高线图呈现圆形，表明初始糖度与初始pH 值的交互作用不显著。图2（b）中，初始糖度固定在零水平时，随着初始pH 值和发酵温度的升高，活菌数呈现先增加后下降的趋势，同时响应面坡度较缓，等高线图类似于圆形，这表明初始糖度和发酵温度的交互作用不显著。图2（c）中，随着初始pH 值和发酵温度的提升，活菌数呈增加趋势，当初始pH 值和发酵温度都增大到一定程度时，苹果浆发酵的活菌数达到最大值，而当两者继续增加时，活菌数却降低，单独提高初始pH 值或发酵温度，都不会使活菌数达到最大。因此，只有初始pH 值和发酵温度在适当值时，才能使发酵结束时的活菌数最高。由此说明，初始pH 值和发酵温度的交互作用显著。

2.2.4 发酵工艺条件验证

通过Design-Expert 8.0 统计软件联合求解模型方程得出苹果浆发酵的最优条件为初始糖度14.31 °Bx，初始pH 值4.39，发酵温度33.21 ℃，当苹果浆发酵结束时，乳酸菌活菌数达到8.76 lg（CFU/mL）。考虑到实际操作条件，将苹果浆发酵工艺参数优化为初始糖度14°Bx，初始pH 值4.4，发酵温度33.2 ℃，检验响应面优化法得到结果的可靠性。

苹果浆发酵过程中pH 值、初始糖度、植物乳杆菌活菌数的变化见图3。

由图3 可知，pH 值总体呈下降趋势，初始糖度无显著变化，活菌数呈上升趋势。原因可能是植物乳杆菌在发酵8 h 后进入对数生长期，可能是植物乳杆菌迅速生长繁殖，分解糖类物质产生大量乳酸，使得苹果浆的pH 值迅速降低，活菌数呈上升趋势。发酵结束时，pH 值下降至3.57，活菌数从5.69 lg（CFU/mL） 增加到8.56 lg（CFU/mL），这与模型预测值误差为2.28%，说明该模型的预测性较好，优化的发酵工艺可靠。

2.3 植物乳杆菌发酵苹果浆对游离态多酚和结合态多酚的影响

酚类物质是植物通过戊糖酸途径，莽草酸酯途径和苯丙素途径产生的次级代谢物，是果蔬中最重要的功能性成分[21]，酚类物质按其形态可将其分为游离态多酚和结合态多酚。苹果中结合态多酚与纤维、果胶等生物大分子结合后会使酚羟基被隐藏，在胃、小肠等上消化道内无法被直接吸收利用，只有进入结肠后，在肠道微生物的参与下发生转化，释放为游离多酚或降解为小分子酚酸，从而发挥其生理活性[22]。

对照品和苹果浆中多酚的HPLC 色谱图见图4，苹果浆发酵对游离态多酚和结合态多酚的影响见图5。

通过比对样品色谱峰和标准品的保留时间，确定了发酵前后苹果浆中游离态多酚和结合态多酚的变化，如图5（a） 所示，对于游离态多酚，除槲皮素外，其余多酚的种类和含量都发生了显著性（p＜0.01） 变化。其中，没食子酸的比例从1.13%升到8.17%，绿原酸的比例从11.53%升到18.51%，芦丁的比例从1.75%升到2.33%，槲皮素的比例几乎不变约占1.3%，表儿茶素和槲皮苷全部消失，根皮素小幅度增加；如图5（b） 所示，对于结合态多酚，没食子酸的比例减少了1.18%，表儿茶素的比例减少了35.1%，结合态芦丁和槲皮素全部消失。结果表明，植物乳杆菌发酵苹果浆后游离多酚含量显著提高，其原因可能在于乳酸菌发酵会产生某些特殊酶类（如淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶），水解与结合态多酚相连的多糖和蛋白质等物质，进而将结合态多酚转化为游离态多酚。因此，苹果浆中游离态多酚含量上升，而结合态多酚含量降低。试验结果与赖婷等人[23]利用7 种不同乳酸菌发酵桂圆肉研究及Wu S C 等人[24]利用3 种不同乳酸菌（植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和拟干酪乳杆菌） 发酵对石莲花多酚含量变化的结果相似，表明植物乳杆菌发酵后，游离态多酚含量增加最多，释放结合态多酚能力最强，由此可见由植物乳杆菌可以改善多酚组成，提高果蔬的生物活性。

2.4 植物乳杆菌发酵苹果浆对抗氧化性的影响

苹果多酚具有多种生理活性，其中抗氧化能力约是维E 的50 倍，维C 的20 倍。多酚含量的变化会影响其体外抗氧化活性。因此，在已证明植物乳杆菌发酵果浆中结合态多酚含量减少，游离态多酚含量增加之后，试验进一步通过比较发酵前后苹果浆对DPPH 和ABTS 自由基的清除率，探究植物乳杆菌发酵对苹果浆抗氧化活性的影响[25]。

苹果浆发酵对DPPH 和ABTS 自由基清除率的影响见图6。

如图6 所示，对比发酵前后苹果浆对2 种自由基清除率的影响发现，发酵后的苹果浆对2 种自由基的清除率均有显著提升（p＜0.01），其中发酵前苹果浆对DPPH 自由基和ABTS 自由基清除率为80.65%和75.57%，发酵后提高为94.72%和87.63%，表明其抗氧化活性增强。原因可能是在发酵过程中，植物乳杆菌对结合态多酚进行生物转化，释放为游离态多酚，使发酵后苹果浆的游离态多酚含量上升。同时，游离态多酚结构上的酚羟基极易被氧化，且具有较强的捕获自由基能力，不但可以有效抑制自由基产生，也可以有效清除人体内过剩的活性自由基，发挥其抗氧化作用[26]。这与Mousavi Z E 等人[27]利用植物乳杆菌等乳酸菌混合发酵石榴果汁可以有效提高石榴果汁的DPPH 自由基清除能力及李虹甫等人[28]利用植物乳杆菌发酵蓝莓果汁发现发酵后蓝莓果汁DPPH 自由基清除率显著提高测定结果相似。由此可见，植物乳杆菌发酵果蔬不但可以增强了抗氧化活性，同时也可以有效改善自由基带来的氧化损伤[29]。

3 结论

基于单因素试验及响应面优化试验对植物乳杆菌发酵苹果浆的工艺优化，探究苹果浆发酵前后多酚含量的变化及其抗氧化能力。结果表明，影响发酵苹果浆中植物乳杆菌活菌数的主要因素依次为发酵温度、初始pH 值、初始糖度，最佳发酵条件为初始糖度14 °Bx，初始值pH 4.4，发酵温度33.2 ℃；发酵后苹果浆中游离态多酚含量上升，而结合态多酚含量下降；发酵后苹果浆抗氧化能力也明显提高。因此，采用植物乳杆菌发酵苹果浆利于开发苹果浆功能食品，后续可针对风味物质和感官指标等进行研究，进一步提高产品风味与稳定性。