宁夏‘灵武长枣’采后病原真菌的分离与鉴定*

任苗苗，闫思远，李嘉泓，杜 娟，马 玲，顾沛雯

（宁夏大学农学院，银川 750021）

‘灵武长枣’（Ziziphus jujubecv.Lingwu）为鼠李科枣属植物，是宁夏回族自治区最具特色的地方枣品种。2006年被国家农业部批准为国家地理标志产品[1]，2019年入选中国农业品牌目录产品[2]。近年来，随着宁夏种植业结构的调整，‘灵武长枣’产业规模迅速发展壮大，已取得良好的经济效益[3]。然而，由于‘灵武长枣’以鲜食为主，皮薄、多汁，鲜销期短，采后贮运不当，腐败现象严重。其中，由真菌侵染引起的果实腐烂可占采后损失的30%～40%[1]，严重制约了宁夏‘灵武长枣’产业化发展。

病原真菌侵染是导致枣采后腐烂的重要因素，但不同地区、品种的枣采后病原真菌的种类有所不同。刘春琴等[4]报道河北地区‘金丝小枣’采后腐烂的主要病原真菌有性阶段是囊孢壳菌（Physalospora obtuse）、无性世代为梭壳孢菌（Fusicoccumsp.）；孙蕾等[5]从山东地区‘冬枣’腐烂组织中主要分离出根菌索菌（RhizomorphaRoth.ex Fr.）和交链孢霉属（Alternariasp.）2种病原真菌；雷春军等[6]发现导致新疆阿克苏地区‘骏枣’采后腐烂的优势病原真菌为交链格孢（A.alternata）、细极链格孢（A.tenuissima）和根霉菌（Rhizopus stolonifer）。但是目前国内对宁夏地区‘灵武长枣’采后病原真菌的研究报道相对较少，2007年甘瑾等[7]采用形态学的方法鉴定‘灵武长枣’采后病原真菌为微孢毛霉（Mucor microsporus）、粉红聚端孢（Trichoderma roseum）、交链格孢（A.alternata）和青霉属（Penicilliumsp.）；2012年，任玉锋等[8]证实皮落青霉（Penicillium crustosum）也是导致‘灵武长枣’采后腐烂的病原真菌。

本研究以宁夏地区‘灵武长枣’为研究对象，通过形态学与分子生物学相结合的方法，对‘灵武长枣’采后病原真菌进行了分离鉴定，明确了宁夏地区‘灵武长枣’采后病原真菌类型，以期为宁夏地区‘灵武长枣’的采后保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年9—11月，从宁夏银川市和灵武市采摘大小均匀、无病虫害和机械损伤的‘灵武长枣’，样品共90份。当天用牛皮纸包好带回实验室，自然条件（25 ℃）下贮藏，待出现典型腐烂症状后进行病原真菌的分离鉴定。

1.2 主要仪器、试剂和培养基

正置荧光显微镜（Olympus BX53，日本），梯度PCR仪（Bio-Rad T100，美国），电泳仪（DYY-C6，北京），凝胶成像系统（Azure c200，美国），霉菌培养箱（MJX-100B-Z，上海），洁净工作台（SW-CJ-1F，苏州）。

真菌DNA提取试剂盒（BioFlux，美国），DL2000 DNA Marker、2×EasyTaq PCR Super Mix、RNaseA和GelStain染液（TIANGEN，北京），50×TAE缓冲液、RNase-Free Water（Solarbio，北京）。

马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基（陆桥，北京）。

1.3 病原真菌的分离和纯化

病原真菌分离采用组织分离法[9]。在‘灵武长枣’病果中病健交界处切取大约5 mm×5 mm×5 mm大小的组织块，置于75%（v/v）的酒精中30 s，消除表面起泡，迅速将组织块用无菌滤纸吸取表面酒精，移入5%（m/v）的次氯酸钠溶液中浸泡3 min，再用无菌水清洗3次后，用灭菌滤纸吸干组织块表面水分，用无菌刀切除组织块表面部分，取大约2 mm×2 mm×2 mm植入PDA培养基中，25 ℃黑暗培养。当菌落直径生长至1 cm时，用无菌接种针挑取不同菌丝尖端分别植入新的PDA培养基平皿内，继续培养。重复上述操作2～3次，分出单一菌落即可作为纯化菌种移入试管，纯化菌种4 ℃保存备用。

1.4 病原真菌的致病性检测

采用阳秀莲等[10]菌悬液有伤接种方法进行致病性检测，略作修改。病原真菌菌悬液的配制：将分离纯化的病原真菌接种至PDA培养基上，25 ℃黑暗培养5 d，进行菌种活化。加入2 mL无菌水冲洗PDA培养平板，收集菌丝和孢子混液，用双层无菌纱布过滤混液，得到病原真菌菌悬液。用血球板计数，将病原真菌菌悬液稀释至1×105cfu/mL，接种备用。有伤接种：取健康‘灵武长枣’果实，用无菌水冲洗数次后，用5%（m/v）次氯酸钠溶液消毒3 min，无菌水冲洗3次，无菌吸水纸吸干水分。用无菌接种针轻轻刺伤果皮制造伤口（伤口集中），取制备好的菌悬液20 μL滴加到刺伤部位。将接种后的‘灵武长枣’果实放入无菌培养皿内，置于智能人工气候箱25 ℃、相对湿度90%条件下培养7 d。每处理重复3次，设无菌水为对照。记录发病情况，通过致病性确认后的病原真菌进行再次分离，并与最初接种的病原真菌进行比较。

1.5 病原真菌的形态学鉴定

将具有致病性的病原真菌接种于PDA平板上，置于25 ℃霉菌培养箱培养4～10 d，观察记录菌落特征（菌落形状、颜色和质地等），待其产孢后，挑取少量菌丝进行镜检和拍照（分生孢子梗和分生孢子形态）。参考《真菌鉴定手册》[11]和《中国真菌志》[12]，鉴定病原真菌种类。

1.6 病原真菌的分子生物学鉴定

1.6.1病原真菌DNA的提取

将纯化后的病原真菌在PDA培养基上活化培养4～10 d后，用无菌的载玻片轻轻在PDA培养基表面上刮取适量新鲜菌丝约0.05 g进行DNA的提取，其方法参照Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒说明。

1.6.2病原真菌rDNA-ITS序列扩增

以纯化后的病原真菌总DNA为模板，利用真菌rDNA-ITS通用引物序列ITS1/ITS4 （5′-TCCGT AGGTGAACCTGCGC-3′）/（5′-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3′）进行扩增和测序。PCR扩增体系（25 μL）：2×PCR buffer 12.5 μL，10 μmol/L引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，51 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，34个循环；72 ℃再延伸10 min。4 ℃保存。扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳中检测，凝胶成像系统观察拍照。PCR扩增产物回收后送至北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.6.3病原真菌系统发育树的构建

将病原真菌菌株测序所得序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，筛选与病原真菌ITS序列同源性高的菌株序列，利用DNAMAN 6.0.3.48软件中邻接法（Neighbor-Joining methods，NJ）构建系统发育树，确定病原真菌菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 ‘灵武长枣’贮藏期病害症状及病原真菌的分离结果

‘灵武长枣’贮藏期间表现出的病害症状主要有5种：①病果初期果面形成边缘明显、略凹陷的黑色斑点，随着侵染斑逐渐扩大，病斑上长出墨绿色或黑褐色霉状物，后期形成较大的腐烂区（图版2a-B）。②感病初期果面出现水渍状的斑点，果面轻微凹陷，后期病斑下果肉迅速软化腐烂，但无水渍溢出，且果实表皮无破损，不产生霉层（图版2a-C）。③果实发病部位初期形成暗褐色斑点，果实轻微凹陷，后期病斑扩展，长出白色霉层（图版2a-D）。④初期果面上出现不规则水渍斑，中后期病斑扩展迅速，果面密被灰褐色团粒状柔软霉层，严重时可导致整个果实腐烂（图版2a-E）。⑤初期果面上发病部位长有白色菌丝，后期蔓延呈白色棉絮状，其上密生黑色小颗粒，病果迅速软化散发出酒糟味（图版2a-F）。

对自然条件下贮藏的‘灵武长枣’腐烂组织进行分离纯化，共得到75株真菌菌株。根据其培养形状及菌落特征初步划分为9种类型。如表1所示，Ⅰ类真菌分离最多（31株），所占比率为分离菌株总数的41.3%；其次是Ⅵ类（11株）和Ⅸ类（8株）真菌，分别占总分离菌株的14.7%和10.7%。

表1 从‘灵武长枣’腐烂果实中分离的真菌菌株

2.2 病原真菌的致病性检测

将从‘灵武长枣’腐烂组织中分离的9类纯化代表菌株（LW1～LW9）依照柯赫氏法则重新接种于健康‘灵武长枣’，从致病的‘灵武长枣’果实腐烂组织再次分离病原真菌，在PDA培养基上纯化培养后，与最初的接种菌进行比较。结果显示，菌株LW1、LW4、LW5、LW6和LW9均会引起‘灵武长枣’果实腐烂，与自然条件下引起的腐烂症状相似，再次分离得到的菌株与原接种的病原真菌菌落形态一致，而菌株LW2、LW3、LW7、LW8及对照接种后并未引起‘灵武长枣’果实腐烂，表明以LW1、LW4、LW5、LW6和LW9为代表的5类真菌是造成‘灵武长枣’果实腐烂的致病真菌。其中，LW1真菌菌丝附着处会造成果肉软化、凹陷和变褐，病果表面出现黑色霉状物产生大量分生孢子，致病较快且效果明显（图版2b-A）；LW4真菌侵染后造成病斑处果肉凹陷腐烂，后期病斑蔓延，果肉出现一定程度的水渍化（图版2b-B）；LW5真菌致病中心呈红褐色，其上着生白色菌丝，对‘灵武长枣’表皮的侵染性较强，造成果实凹陷（图版2b-C）；LW6真菌接种后‘灵武长枣’表面出现水渍状斑点，随着病菌侵染，果皮呈灰白色，后期果面上形成厚厚的灰褐色霉层（图版2b-D）；LW9真菌侵染后伤口处出现白色棉絮状菌丝，在菌落覆盖下方及菌落周围的果实组织腐坏严重，致病性较强（图版2b-E）。

2.3 病原真菌形态学鉴定

PDA培养基上生长的纯化菌株LW1菌落近似圆形，中央墨绿色，边缘白色，菌丝致密呈棉絮状（图版2b-F）；分生孢子梗直立、分隔；分生孢子呈倒棍棒形或椭圆形，单孢 9.82～13.85 μm×19.77～28.80 μm，具有1～5个横膈膜，分隔处略有缢缩（图版2b-K）。

LW4菌落生长较慢，边缘不规则，初期污白色，后期颜色加深变黑，菌丝呈根状，黏稠，不易挑取，（图版2b-G）；分生孢子椭圆形，显微镜下呈单细胞个体，9.25～12.05 μm×10.97～14.38 μm（图版2b-L）。

LW5菌落边缘不整齐，初期呈白色丝绒状，后变为褐色至黑褐色，约15 d后开始产生黑色菌核（图版2b-H）；分生孢子呈球形或长椭圆形，无色，单细胞2.65～5.96 μm×7.86～11.30 μm（图版2b-M）。

LW6菌落生长较快，初期呈灰白色，产孢后呈灰褐色，菌丝体繁茂，绒毛状（图版2b-I）；分生孢子梗丛生，顶端着生大量分生孢子，形似葡萄穗状；分生孢子呈球形或卵圆形，无隔，单孢7.18～9.54 μm×13.01～14.56 μm，透明或呈淡褐色（图版2b-N）。

LW9菌落无定形，气生菌丝，菌丝最初为白色棉絮状，后期顶端产生黑色小颗粒（图版2b-J）；菌丝发达、有分枝和假根；孢子囊球形或近球形，深褐色，孢囊孢子呈球形或近似球形，大小不等（图版2b-O）。

依据病原菌培养形态特征及镜检观察结果，参考《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》，初步鉴定结果为：菌株LW1为链格孢属（Alternaria），LW4为短梗霉属（Aureobasidium），LW5为派伦霉属（Peyronellaea），LW6为葡萄孢属（Botrytis），LW9为根霉属（Rhizopus）。

2.4 病原真菌的分子生物学鉴定

采用真菌rDNA-ITS序列通用引物（ITS1和ITS4）对菌株LW1、LW4、LW5、LW6和LW9进行分子生物学鉴定。以5株病原真菌的总DNA为模板进行PCR扩增检验，获得578、579、549、625、554 bp的基因片段（图1），将PCR产物测序结果与NCBI中相似性高的菌株rDNA-ITS基因序列进行同源性比对，构建系统发育树（图 2）。按rDNA-ITS基因序列相似性大于97%的菌株归于同一个种的规则，菌株LW1（登录号：MN073201）与链格孢属的A.alternata（登录号：MF167641）亲缘关系最近，同源率为99%，鉴定为交链格孢（A.alternata）；菌株LW4（登录号：MN075511）与短梗霉属的Aureobasidium pullulans（登录号：MK772062）亲缘关系最近，同源率达100%，鉴定为出芽短梗霉（A.pullulans）；菌株LW5（登录号：MN075513）与派伦霉属的Peyronellaea glomerata（登录号：KT192373）亲缘关系最近，同源率为99%，鉴定为球派伦霉（P.glomerata）；菌株LW6（登录号：MN077159）与葡萄孢属的Botrytis cinerea（登录号：MF467899）和Botrytis fabae（登录号：KC213772）亲缘关系最近，同源率为98%，结合菌株LW6形态学特征鉴定为灰葡萄孢（B.cinerea）；菌株LW9（登录号：MN075516）与根霉菌属的Rhizopus oryzae（登录号：MH865593、MH854585和MH854584）亲缘关系最近，同源率为99%，鉴定为米根霉（R.oryzae）。

图1 病原真菌rDNA-ITS基因序列的PCR扩增

图2 病原真菌LW1、LW4、LW5、LW6和 LW9 rDNA-ITS序列系统发育树

3 结论与讨论

‘灵武长枣’属于呼吸跃变型果实[13]，采后易失水皱缩、软化、褐变和腐烂，低温（15 ℃）环境下货架期仅10～15 d[14]，保鲜期短成为‘灵武长枣’产业发展亟需解决的重要难题。本研究从‘灵武长枣’腐烂组织中共分离出9类真菌菌株，通过致病性测定，确定有5类真菌可以引起‘灵武长枣’腐烂，经形态学特征和分子生物学分析，分别鉴定为交链格孢（A.alternata）、出芽短梗霉（A.pullulans）、灰葡萄孢（B.cinerea）、米根霉（R.oryzae）和球派伦霉（P.glomerata）。

高芬等[15]认为山西‘赞皇大枣’黑腐病是由细极链格孢（A.tenuissima）引起的，何丽等[16]认为新疆红枣黑腐病是由交链格孢（A.alternata）引起的，甘瑾等[7]发现交链格孢（A.alternata）也可以导致‘灵武长枣’采后腐烂。本研究根据贮藏期‘灵武长枣’腐烂组织病原菌分离频率（41.3%）及致病性检验，发现交链格孢（A.alternata）是引起‘灵武长枣’黑腐病的主要病原真菌，可导致枣果面凹陷，果皮黑腐，密生黑褐色霉层，果肉软化、变褐等症状，造成果品腐烂变质。枣贮藏期黑腐病病原不一致，可能是由于枣果产地、品种、贮藏条件及病样采集时病害发展进程不同，造成黑腐病病原种类存在一定的差异。灰葡萄孢（B.cinerea）和米根霉（R.oryzae）是常见的果蔬致腐微生物，寄主范围广泛，在有伤和无伤条件下均可侵入果实组织，导致葡萄[17]、红枣[18]和番茄[19]等多种果蔬采后腐烂。李青云[20]研究发现灰葡萄孢（B.cinerea）是引起北疆‘冬枣’采后腐烂的主要病原真菌；白剑宇等[18]对新疆红枣软腐病病原菌进行鉴定，明确了致病真菌为米根霉（R.oryzae）。本研究得到了类似的结论，灰葡萄孢（B.cinerea）和米根霉（R.oryzae）也是导致‘灵武长枣’果实采后腐烂的重要致病真菌。

此外，本研究还首次发现出芽短梗霉（A.pullulans）和球派伦霉（P.glomerata）是‘灵武长枣’采后病原真菌，通过有伤接种，‘灵武长枣’被2种病原真菌感染后，果面出现凹陷病斑或产生白色霉层，最终导致全果腐烂，可见这2种病原真菌具有较强的致病性。Nallathambi等[21]发现出芽短梗霉（A.pullulans）是引起‘台湾青枣’腐烂的主要病原菌，侵染后可导致枣果面出现凹陷病斑并产生黑色霉层等症状；萨吉达木·艾则孜等[22]研究证明，新疆红枣出现畸果症状和果面出现褐色斑点现象是由球派伦霉（P.glomerata）侵染引起的。出芽短梗霉（A.pullulans）和球派伦霉（P.glomerata）对不同枣的侵染症状存在较大的差异，这可能也与枣果产地、品种和贮藏条件等相关，但有关2种病原真菌的侵染致腐过程及致腐机理等方面还尚不明确，仍需进一步研究。

本研究明确了引起‘灵武长枣’采后腐烂变质的主要病原真菌为交链格孢（A.alternata）、灰葡萄孢（B.cinerea）、米根霉（R.oryzae）、出芽短梗霉（A.pullulans）和球派伦霉（P.glomerata），这将为控制‘灵武长枣’采后腐烂和提出针对性的防腐贮藏手段提供借鉴和思路。已有研究发现，低温、减压和臭氧（-2 ℃、40.5 kPa和O3mg/m3）处理不仅能够减缓‘冬枣’淀粉和抗坏血酸降解速度，还具有抑制交链格孢孢子繁殖和降低枣果腐烂的作用[23]。此外，通过对长枣喷施不同浓度隐球酵母（Cryptococcussp.）菌悬液，能够诱导长枣抗病性，大大降低了由根霉菌引起的烂果率[24]。‘冬枣’采后，利用丁香精油和丁香精油-壳聚糖复合物处理枣果，可以降低‘冬枣’贮藏期灰霉病感染率[25]。因此，结合现有的广谱杀菌措施，针对‘灵武长枣’采后病原真菌筛选有效的选择性杀菌剂，可以为预防‘灵武长枣’采后致腐病害和延长货架期提供技术支撑。