花旗松素在小鼠心肌肥厚及纤维化中的作用及机制研究

吕瑾 刘长召 华晓芳 杨胜祥

心肌重构指各种病理生理刺激引起心脏形态、结构和功能改变，其特征是心肌细胞体积增大，心室壁厚度增加，心脏成纤维细胞过度活化并产生大量细胞外基质，进而导致心脏顺应性及舒缩功能下降，最终诱发心力衰竭[1]。靶向抑制心肌肥厚和纤维化，对延缓心肌重构进程及治疗心力衰竭具有重要意义。

花旗松素(taxifolin，TXL)也称为二氢槲皮素，是松科植物(如花旗松和红豆杉)中常见的黄酮类物质。TXL具有抗癌、抗氧化、抗炎和抗菌等活性[2]。TXL可通过协同抑制Janus激酶2/信号转导与转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路减轻小鼠脑组织淀粉样变[3]，还可通过调节Notch1信号通路和JAK2/STAT3信号通路影响辅助性T细胞(Th细胞)活化，减轻小鼠中咪喹莫特诱导的银屑病[4]。STAT3介导的炎性反应是导致心肌重构的重要机制[5]。因此，TXL可能够通过调节小鼠心肌中STAT3介导的炎性反应，抑制压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚及纤维化。本研究通过构建主动脉缩窄术(AB)诱导的小鼠心肌重构模型，观察并探究TXL对小鼠心功能、心肌肥厚及纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

TXL(HY-N0136)购自于上海MCE公司，纯度≥98%；抗CD45、CD68、p-STAT3、t-STAT3及GAPDH抗体均购自于美国Abcam公司；免疫组织化学DAB试剂盒(GK600710)购于美国Gene-tech公司；羊抗兔IgG二抗购于美国LICOR公司。

1.2 实验动物及模型建立

6～8周雄性C57/B6小鼠体质量230～300 g，购于湖北省预防医学科学院动物中心。根据随机数表法将30 只小鼠随机分为假手术组、AB组及AB+TXL组，每组10只。AB组和AB+TXL组手术操作步骤如下：(1)经腹腔注射给予小鼠 3%异戊巴比妥麻醉，同时经口气管插管辅助呼吸。(2)沿小鼠胸部2～3肋间隙水平方向切开皮肤并分离降主动脉，将26号针置于主动脉旁并结扎。(3)结扎后迅速拔出针头，逐层缝合小鼠肌肉及皮肤。术后8周可成功建立压力负荷诱导的心肌肥厚及纤维化模型。AB+TXL组小鼠于AB术后第2天开始，每日上午9点给予20 mg/kg TXL灌胃，持续8周。

1.3 多普勒超声检测

各组小鼠通过吸入1.5%异氟烷麻醉，剔去其心前区毛发，放置于37 ℃的恒温加热板。采用MyLab 30CV多普勒超声诊断仪检测各组小鼠心功能。在靠近小鼠乳头肌水平的胸骨旁长轴和胸骨旁短轴上以2D模式成像，记录2D引导下穿过左心室前壁和后壁的M型超声，收集心率(HR)、左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室收缩末期内径(LVESD)及左室舒张末期内径(LVEDD)等参数，各参数取4个连续心动周期的平均值。超声检测后，通过颈椎脱臼法处死各组小鼠，测量体质量，获取小鼠心脏，用吸水纸擦干心脏残余液体，测量心脏质量，计算心脏质量与体质量的比值(HW/BW)。

1.4 实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测

取小鼠左室心肌20～30 mg，剪碎并研磨后提取总RNA。利用紫外分光光度计检测所获RNA 的浓度及纯度，通过AMV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA。对cDNA进行qRT-PCR扩增，反应体系为：1 μL cDNA，10 μL SyBr Green，8 μL DEPC水，0.5 μL正向引物及反向引物(见表1)。以β-actin作为内参基因进行校正。

表1 实时聚合酶链反应引物序列

1.5 Western blot检测

将各组心肌组织在裂解缓冲液中充分研磨后进行超声裂解，将裂解液离心后吸取上清，采用BCA法测量总蛋白浓度。取各组小鼠心肌组织总蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后，将蛋白转至醋酸纤维素膜，加入抗p-STAT3、t-STAT3及GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，加入羊抗兔二抗，避光孵育1 h，利用Odyssey扫膜仪对蛋白条带进行扫描并定量，以GAPDH作为内参蛋白进行校正。

1.6 HE染色及PSR染色

将各组心肌组织放置于10%福尔马林中过夜，脱水后石蜡包埋、切片。对切片进行HE染色：将切片分别置于二甲苯、浓度梯度的乙醇及苏木素中浸泡，树脂封片，光镜下观察并拍照。对切片进行PSR染色：切片经二甲苯及浓度梯度的乙醇脱水后，在天狼星红饱和苦味酸液中浸泡20 min，无水乙醇分化与脱水后封片，光镜下观察并拍照。Image-ProPlus 6.0软件评估各组心肌细胞横截面积及心肌组织中胶原百分比。

1.7 免疫组化检测

各组心肌石蜡切片于二甲苯及浓度梯度乙醇中分化脱水，3%双氧水甲醇抑制内源性过氧化物酶活性，羊血清封闭1 h，分别加入抗CD45抗体(1∶200)和抗CD68抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜。加入二抗后，用二氨基联苯胺进行显色。每组随机选择 6个样本，每个样本随机选取5个视野，在光镜下观察并拍照。

1.8 统计学分析

所有数据均采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差来表示，两组间比较采用t检验，3组及以上组间比较用One-way ANOVA分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠心功能检测

3组小鼠心室率无统计学差异，表明各组心功能具有可比性。与假手术组小鼠相比，AB组小鼠LVEF及LVFS明显降低，LVEED及LVESD明显升高(P均<0.05)；与AB组小鼠相比，AB+TXL组小鼠LVEF及LVFS明显升高，LVEED及LVESD亦明显降低(P均<0.05)，见表2。

2.2 各组小鼠心肌肥厚指标检测

与假手术组相比，AB组小鼠心脏大体横截面积及心肌细胞横截面积明显增大，心脏质量/体质量比值明显升高，心肌肥厚标志基因ANP mRNA表达水平明显上调(P均<0.05)；TXL干预后，AB+TXL组小鼠心脏大体横截面积及心肌细胞横截面积明显减小，心脏质量/体质量比值及ANP mRNA表达水平也明显降低(P均<0.05)。见图1、表3。

表2 3组小鼠心功能比较

图 1 3组小鼠心脏HE染色结果

表3 3组小鼠心肌肥厚指标比较

2.3 各组小鼠心肌纤维化指标检测

与假手术组相比，AB组心肌间质及血管周胶原沉积明显增加，心肌纤维化标志基因Ctgf mRNA表达水平明显上调(P均<0.05)；与AB组相比，AB+TXL组小鼠心肌间质及血管周胶原沉积明显降低，Ctgf mRNA表达水平明显下降(P均<0.05)。见图2、表4。

图 2 3组小鼠心肌间质及血管周PSR染色结果

表4 3组小鼠心肌纤维化指标比较

2.4 各组小鼠心肌组织炎性反应及相关基因表达情况

与假手术组相比，AB组小鼠心肌组织中CD45及CD68的蛋白表达水平明显升高(P均<0.05)，表明AB组小鼠心肌组织中白细胞及巨噬细胞浸润数量明显增多，同时促炎性细胞因子IL-6的mRNA表达水平明显上调(P<0.05)，表明AB组小鼠心肌组织炎性反应被激活。与AB组相比，AB+TXL组小鼠心肌组织白细胞及巨噬细胞浸润数量、IL-6的mRNA表达水平均明显被抑制(P均<0.05)。Western blot结果显示，TXL能够明显抑制AB诱导的小鼠心肌组织STAT3蛋白磷酸化水平(P均<0.05)。见图3、图4、表5。

图 3 3组小鼠心肌组织炎性细胞浸润情况

图 4 3组小鼠心肌组织STAT3通路相关蛋白表达情况

3 讨论

心力衰竭与不良心室重构密切相关[6]。炎性反应是急性心肌梗死后不良重构的驱动因素。缺血应激诱发心脏炎性反应，死亡的心肌细胞释放的损伤相关分子模式(DAMPs)可上调炎性细胞因子和趋化因子的表达，引起心肌组织免疫细胞募集和炎性级联反应[7]。研究表明，心脏炎性反应也可以在非缺血条件下激活。研究表明，胸主动脉缩窄术(TAC)后6周小鼠心肌组织即出现了明显的炎性基因激活及炎性细胞浸润。TAC后数天至数周，心脏中巨噬细胞和T细胞浸润显著增加，且与心肌纤维化和不利的心室重构有关[8]。因此，以心肌组织炎性反应为靶点预防和治疗非缺血因素诱导的心肌肥厚及纤维化具有重要的临床意义。

表5 3组小鼠心肌炎性反应指标及p-STAT3/t-STAT3蛋白表达水平比较

STAT3作为哺乳动物体内重要的转录因子，对维持细胞代谢稳态具有重要意义[9]。研究表明，过表达STAT3能够诱导小鼠心脏发生自发性心肌肥厚。机制上，STAT3可通过转录激活IL-6的表达促进心肌细胞肥大[10]。在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和高盐诱导的高血压模型中，IL-6缺失可抑制心脏炎性反应、心肌纤维化和心功能障碍，但并不影响心肌肥厚[11]。另一方面，心脏特异性过表达STAT3能够抑制化疗药物阿霉素诱导的心肌损伤和心功能不全[10]。在异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚及心肌纤维化模型中，STAT3可直接被活化的β肾上腺素受体激活。敲除心肌细胞STAT3可显著降低心肌收缩功能，引起心肌肥厚及纤维化[12]。在本研究中，我们发现AB术后8周小鼠心肌组织中STAT3磷酸化水平明显升高。同时，IL-6 mRNA的表达水平明显升高，表明在压力负荷诱导的慢性心肌肥厚及纤维化中，STAT3/IL-6介导的炎性信号通路被激活。

TXL是一种天然化合物单体，可在炎症、肿瘤、微生物感染、氧化应激、心血管和肝脏疾病中发挥药理作用。TXL可通过改善线粒体功能及糖代谢减轻邻苯二甲酸二酯诱导的鸡心肌细胞肥大[13]。此外，TXL可通过抑制线粒体凋亡通路减轻大鼠缺血再灌注损伤[14]。Sun等[15]揭示TXL可通过抑制心肌细胞氧化应激和凋亡改善糖尿病心肌病。本研究发现，在压力负荷诱导的心肌肥厚及纤维化中，TXL可明显提高小鼠心脏LVEF及LVFS率，改善心功能。TXL不仅抑制心肌细胞肥大及肥厚基因ANP的表达，还可抑制心肌间质及血管周围胶原沉积及促纤维化基因Ctgf的表达；TXL可能通过抑制STAT3/IL-6介导的炎性反应，减少心肌组织中白细胞和巨噬细胞浸润。因此，TXL可通过抑制心肌组织中STAT3依赖的炎性信号的激活，改善压力负荷诱导的心肌重构，但具体分子靶点仍需进一步研究。