德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物对常见病原菌的抑制作用

2020-12-15胡方兴邬国军

国际检验医学杂志 2020年23期

陈华，彭浩，胡方兴，梁伟，张镓，魏莎，邬国军

(1.湖南省长沙市第三医院检验科，湖南长沙 410015；2.中南大学湘雅三医院烧伤整形外科，湖南长沙 410006；3.中南大学基础医学院微生物学系，湖南长沙 410078)

临床研究表明，许多常见病原菌(如铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等)的耐药性正随着抗菌药物的广泛应用而逐年升高[1-3]。同时，抗菌药物的大量使用，甚至滥用，导致了多重耐药菌的产生，从而严重地破坏机体微生态环境。因此，寻找新的抗菌治疗方法一直是抗微生物感染治疗研究的重点和热点。近年来，采用以菌治菌理念的微生态疗法(微生态移植)治疗相关感染性疾病已取得了一定的成果，但目前的研究主要集中在肠道感染性疾病，特别是难治性或复发性艰难梭菌性肠炎的治疗上[4]。然而常规的微生态移植特别是肠道微生态移植也有一定的不良反应，如可能导致菌血症等[5-6]，故将益生菌用于以菌治菌将具有更大的应用前景。乳酸菌类由于其独特的生物学特性进入了研究者的视野。已有报道乳酸菌用于感染性疾病的治疗，并取得了很好的疗效，其治疗的原理主要涉及该类细菌能产生具有抗菌作用的细菌素等[7-8]。德氏乳杆菌保加利亚亚种俗称保加利亚乳杆菌，广泛应用于发酵乳制品工业[9]，其发酵乳糖产生乳酸，可以有效缓解乳糖不耐症，促进营养成分的利用和吸收，并且能够改善产品的风味。有研究表明，德氏乳杆菌保加利亚亚种可产生细菌素等非抗菌药物的杀菌物质[10]。实验室研究发现，德氏乳杆菌保加利亚亚种对大肠埃希菌具有较强的抑菌和抗黏附作用[11]，对幽门螺杆菌亦具有一定的抑菌活性[12]；而且，目前少有从人类感染性标本中分离出该菌的报道，故该菌可能是抗细菌感染较好的候选细菌。

1 材料与方法

1.1标本来源德氏乳杆菌保加利亚亚种为中南大学基础医学院微生物学系保存；大肠埃希菌(6株)、铜绿假单胞菌(5株)、肺炎克雷伯菌(6株)、居泉沙雷菌(4株)、产气肠杆菌(5株)、鲍曼不动杆菌(7株)、枸橼酸杆菌(4株)、黏质沙雷菌(5株)、嗜麦芽假单胞菌(6株)、金黄色葡萄球菌(8株，其中有3株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、表皮葡萄球菌(6株)等均自长沙市第三医院检验科微生物室分离并保存。

1.2仪器与试剂相对分子质量3×103及10×103超滤离心管为美国Millipore公司产品；截留相对分子质量0.5×103透析袋为美国Viskase公司产品；Infinite F50酶标仪为瑞士Tecan公司产品，营养肉汤培养基及营养琼脂培养基均为杭州微生物试剂有限公司产品；MRS肉汤培养基及MRS琼脂培养基均为杭州百思生物技术有限公司产品；乳酸由日本东芝TBA2000FR全自动生化分析仪测定，试剂盒为北京利德曼生化股份有限公司生产。

1.3方法

1.3.1德氏乳杆菌保加利亚亚种与常见病原菌的共培养试验

1.3.1.1筛选适合德氏乳杆菌保加利亚亚种与常见病原菌混合培养的培养基德氏乳杆菌保加利亚亚种的最适培养基为MRS肉汤培养基，该培养基pH值较低，一般常见病原菌在该培养基中不能很好地生长。常见病原菌的培养基基本为中性或略偏碱性的培养基，在此条件下德氏乳杆菌保加利亚亚种生长不良，为方便对德氏乳杆菌保加利亚亚种和常见病原菌进行共培养以研究前者对后者的抑制作用，本研究首先将营养肉汤培养基及MRS肉汤培养基按不同比例混合，配制成混合培养基，以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及德氏乳杆菌保加利亚亚种为指示菌，测定这3种细菌在这些培养基中的生长曲线，以确定适合常见病原菌及德氏乳杆菌保加利亚亚种混合培养的最适比混合培养基。具体方法为：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌接种于营养肉汤培养基后进行普通培养，将德氏乳杆菌保加利亚亚种接种于MRS肉汤培养基后进行厌氧培养，18～24 h后将菌液作100倍稀释后备用。将MRS肉汤培养基与营养肉汤培养基分别按照0%∶100%(即营养肉汤培养基)、10%∶90%、20%∶80%、30%∶70%、40%∶60%、50%∶50%、60%∶40%、70%∶30%、80%∶20%、90%∶10%、100%：0%(即MRS肉汤培养基)的比例配制成混合培养基。生长曲线测定在96孔细胞培养板中进行，每孔中加入200 μL混合培养基，然后接种相应细菌5 μL，重复4孔，培养，在培养后的4、8、12、16、20、24、48 h各取出一块培养板，微量振荡器振荡混匀后在酶标仪中读取600 nm处的吸光度值，最后以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标作细菌生长曲线图。

1.3.1.2德氏乳杆菌保加利亚亚种对铜绿假单胞菌的抑制作用分别培养铜绿假单胞菌及德氏乳杆菌保加利亚亚种，于对数生长期时收获细菌细胞并计数，然后将铜绿假单胞菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的数量比例混合，编为1～5号，分别接种于1.3.1.1步骤中确定的最适配比混合培养基中，分别在需氧或厌氧培养条件下于37 ℃培养18～24 h后，挑菌液划线接种营养琼脂平板或MRS琼脂培养基，再分别于需氧或厌氧条件下培养，以探讨德氏乳杆菌保加利亚亚种对铜绿假单胞菌的抑制作用及其最适抑制比。

1.3.1.3德氏乳杆菌保加利亚亚种对常见病原菌的抑制作用将处于对数生长期的待测菌及德氏乳杆菌保加利亚亚种按1.3.1.2确定的最适抑制比混合，再培养于最适比混合培养基中，分别进行普通培养及厌氧培养；同时将待测菌接种于含最适配比混合培养基中，普通培养。第2天取菌液接种于营养琼脂平板，于普通有氧条件下培养，研究德氏乳杆菌保加利亚亚种对常见病原菌的抑制作用。

1.3.2德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物的抑菌作用培养目的菌后，将目的菌用营养肉汤培养基稀释为1.5×108CFU/mL的菌液，取100 μL菌液涂布于营养琼脂培平板表面，然后在平板上放置5个牛津杯，向1号杯中加入德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物混悬液(含德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体)，第2号杯中加入德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物上清液，第3号杯中加入调整pH值至7.2的德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物上清液，第4号杯加入pH值4.0乳酸溶液，第5号杯加入MRS肉汤培养基对照，每杯200 μL，37 ℃培养18～24 h观察结果。

1.3.3德氏乳杆菌保加利亚亚种24 h及48 h发酵上清液对常见病原菌抑制作用的比较以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌及产气肠杆菌为试验菌株。培养目的菌，配成1.5×108CFU/mL的菌液后取100 μL涂布于营养琼脂平板，然后在平板上放置牛津杯，并向牛津杯中加入德氏乳杆菌保加利亚亚种24 h及48 h发酵产物上清液，每菌每种发酵产物重复4次，每杯200 μL，37 ℃培养18～24 h后测量抑菌圈直径，研究德氏乳杆菌保加利亚亚种24 h及48 h发酵产物上清液对试验菌株抑制作用的差异。

1.3.4温度对德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物抑菌作用的影响将德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物分装后，分别经60 ℃ 2 h、80 ℃ 2 h、100 ℃ 30 min及120 ℃ 30 min处理，然后以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、鲍曼不动杆菌为检测菌，研究经不同温度处理后的德氏乳标菌保加利亚亚种48 h发酵产物对这些细菌的抑制作用。

1.3.5德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物抑菌作用成分的初步研究

1.3.5.1配制pH值为3.0、4.0、5.0、6.0的磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.3.5.2德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物乙醇沉淀物及乙醇沉淀后的上清液的抑菌作用向8.0 mL德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物中加入无水乙醇使其终浓度达75%，-20 ℃冰箱过夜后12 000 r/min离心10 min，分离上清液并于室温下放置24 h以使乙醇挥发，然后再冷冻干燥，干燥物经8.0 mL蒸馏水复溶后备用。沉淀物用75%乙醇洗涤2次后，除尽上清，并敞开管盖以使乙醇挥发。待沉淀物中乙醇挥发完毕，用不同pH值的PBS溶解，并以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、胞曼不动杆菌、枸橼酸杆菌、产气肠杆菌及黏质沙雷菌为指示菌，利用牛津杯药物敏感试验方法研究德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物的乙醇沉淀物及乙醇沉淀后的上清液的抑菌活性。

1.3.5.3德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物中乳酸浓度测定及该浓度乳酸溶液对铜绿假单胞菌的抑制作用以酶比色法检测德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物中乳酸浓度，然后以0.01 mol/L pH值4.0的PBS配制该浓度的乳酸溶液，用牛津杯法检测该浓度乳酸溶液对铜绿假单胞菌的抑制作用。

1.3.5.4德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物80%饱和度硫酸铵盐析物对铜绿假单胞菌的抑制作用向8.0 mL德氏乳杆菌保加利亚种48 h发酵产物加入32 mL饱和硫酸铵溶液，充分混匀后置4 ℃冰箱过夜，10 000 r/min离心10 min后，去上清液，沉淀以2 mL 0.01 mol/L pH值4.0 PBS溶解，将溶解物中置于截留相对分子质量为0.5×103的透析袋中，用0.01 mol/L pH值4.0 PBS透析72 h，每24 h换透析液一次，最后将透析后的溶液以0.01 mol/L pH值4.0 PBS补足体积至8.0 mL。以铜绿假单胞菌为指示菌用牛津杯实验检测德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物经80%饱和度硫酸铵盐析沉淀物对铜绿假单胞菌的抑制作用。

1.3.5.5德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物中抑菌物质相对分子质量的初步确定将德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物经相对分子质量3×103及10×103的超滤离心管过滤后，以铜绿假单胞菌为指示菌，以牛津杯法检测滤出液及上层液(离心后留在滤膜上的液体)的抑菌活性。另外，将德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物直接置于截留相对分子质量为0.5×103的透析袋中，用0.01 mol/L pH值为4.0 PBS透析72 h，每24 h换透析液一次，最后以铜绿假单胞菌为指示菌，利用牛津杯法检测透析后的发酵产物对其抑制作用，以研究该发酵产物中抑菌活性成分的相对相对分子质量大小。

2 结果

2.1德氏乳杆菌保加利亚亚种与常见病原菌的共培养试验

2.1.1确定适合德氏乳杆菌保加利亚亚种与常见病原菌共培养的培养基研究结果显示，德氏乳杆菌保加利亚亚种在MRS肉汤培养基配比低的混合培养基中生长略差，MRS肉汤培养基配比越高，该菌生长越好，在MRS肉汤培养基配比为20%时，该菌生长速度约相当于纯MRS肉汤培养基中的一半左右；金黄色葡萄球菌在MRS肉汤培养基不同配比的混合培养基中均能生长，但在MRS肉汤培养基配比高的混合培养基中生长略差；铜绿假单胞菌在MRS肉汤培养基配比为50%及以上的混合培养基中几乎不能生长，而在MRS肉汤培养基配比为30%及以下的混合培养基中生长与在营养肉汤培养基中的生长速度相差不大。故后续试验选用MRS肉汤培养基配比为20%的混合培养基作为德氏乳杆菌保加利亚亚种与临床常见病原菌共培养的最适比混合培养基。

2.1.2德氏乳杆菌保加利亚亚种对铜绿假单胞菌的抑制作用及最适抑制比的确定共培养试验显示当铜绿假单胞菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种数量比在1∶3以上时，混合培养基中均分离不出铜绿假单胞菌，但全部混合培养基中均可分离出德氏乳杆菌保加利亚亚种，表明德氏乳杆菌保加利亚亚种3倍于铜绿假单胞菌及以上时对该菌的生长具有显著抑制作用。

2.1.3德氏乳杆菌保加利亚亚种对常见病原菌的抑制作用将临床常见病原菌分别与德氏乳杆菌保加利亚亚种按1∶3的数量比混合培养于MRS肉汤培养基配比为20%的混合培养基中，结果表明，德氏乳杆菌保加利亚亚种比例3倍于目标菌时对这些病原菌均有明显的抑制作用。

2.2德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物的抑菌作用利用牛津杯法研究德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物混悬液(含德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体)及48 h发酵产物上清液对常见病原菌的抑制作用，结果显示，牛津杯中加入调整pH值至7.2的发酵产物、pH值为4.0乳酸溶液及MRS肉汤培养基对照的周围均无抑菌圈出现，而牛津杯中加入德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物混悬液及上清液的周围有明显的抑菌圈，其中48 h发酵产物混悬液对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌的抑制作用强于48 h发酵产物上清液(P<0.05)，表明德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物对多种常见的革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌均具有较强的抑制作用。见表1。

2.3德氏乳杆菌保加利亚亚种24 h及48 h发酵上清液对常见病原菌的抑制作用利用牛津杯抑菌试验研究德氏乳杆菌保加利亚亚种24 h及48 h发酵产物上清液对临床常见病原菌的抑制作用，结果显示，48 h发酵产物上清液对表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的抑制作用略强于24 h发酵产物上清液(P<0.05)，而对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌的抑制作用与24 h发酵产物上清液相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物混悬液及上清液对常见病原菌的抑制作用

表2 德氏乳杆菌保加利亚亚种24 h及48 h发酵产物上清液对常见病原菌的抑制作用

2.4德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物抑菌活性的热稳定性测定结果显示，德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物经分别经60 ℃ 2 h、80 ℃ 2 h、100 ℃ 30 min及120 ℃ 30 min处理后，对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌及鲍曼不动杆菌的抑菌活性几乎无影响，表明德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物中的抑菌成份具有良好的热稳定性。

2.5德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物抑菌作用成分的初步研究

2.5.1德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物的乙醇沉淀物及乙醇沉淀后的上清液的抑菌作用结果显示，德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物的乙醇沉淀物对表中的测试菌均失去了抑菌活性，而乙醇沉淀后的上清液对测试菌仍具备良好的抑菌作用，但抑菌活性均略低于德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物(P<0.05)。表明德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物中的抑菌物质不能被75%乙醇沉淀，但发酵产物中的抑菌活性物质可能会被75%乙醇部分灭活。见表3。

表3 德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物及乙醇沉淀上清液的抑菌活性

2.5.2德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物中乳酸对铜绿假单胞菌的抑制作用利用乳酸测定试剂盒对德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物中的乳酸浓度进行测定，结果该发酵产物中乳酸浓度为20 mmol/L。配制20 mmol/L乳酸溶液，利用牛津杯法检测该溶液对铜绿假单胞菌的抑制作用。结果在加有20 mmol/L乳酸溶液的牛津杯周围无抑菌圈出现，表明20 mmol/L的乳酸溶液不具备对铜绿假单胞菌的抑制作用。

2.5.3德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物80%饱和度硫酸铵盐析沉淀物对铜绿假单胞菌的抑制作用将德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物经80%饱和度硫酸铵盐析，盐析沉淀物以0.01 mol/L pH值为4.0 PBS溶解并对该缓冲液进行透析，以牛津杯法检测盐析沉淀物对铜绿假单胞菌的抑制作用，结果显示，在加有该菌48 h发酵产物80%饱和度硫酸铵盐析沉淀物的牛津杯周围无抑菌圈出现，表明德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物的80%盐析沉淀物对铜绿假单胞菌无抑制作用。

2.5.4德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物中抑菌物质的相对分子质量将德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物上清液经相对分子质量3×103及10×103的超滤离心管过滤后，以铜绿假单胞菌为指示菌，以牛津杯法研究了滤出液及上层液对指示菌的抑菌活性。结果显示，不管是发酵产物经超滤离心管过滤后的上层液、还是滤出液，均显示明显的抑菌活性，表明这些抑菌活性物质的相对分子质量在3×103左右或以下。

将德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物置于截留相对分子质量为0.5×103的透析袋中，用0.01 mol/L pH值为4.0 PBS透析72 h后，以铜绿假单胞菌为指示菌，检测透析后的发酵产物对其抑制作用。结果显示，在加有透析后德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物的牛津杯周围无抑菌圈出现，表明德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物经相对分子质量0.5×103透析袋透析后对铜绿假单胞菌的抑菌作用消失。

3 讨论

乳酸菌是一类能够发酵碳水化合物产生大量乳酸的无芽孢、革兰染色阳性细菌的总称，主要有乳杆菌属、乳球菌属、双歧杆菌属等43个菌属，广泛存在于人和畜禽肠道及多种发酵食品中[10,13-14]。乳酸菌的抗微生物活性归因于其在代谢过程中产生多种抗微生物活性物质，如乳酸、苯乳酸、乙酸、过氧化氢、二氧化碳、细菌素及其他低相对分子质量化合物[15]。由于这些特性，某些乳酸菌如植物乳杆菌已被开发为抗微生物感染的新型生物制剂并应用于临床上烧伤的治疗，显示出良好的临床应用效果[16]。

本研究对铜绿假单胞菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种进行共培养试验，结果显示，铜绿假单胞菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种数量比在1∶3以上时，铜绿假单胞菌的生长受到完全抑制，表明共培养时德氏乳杆菌保加利亚亚种对铜绿假单胞菌有较强的抑制作用。同时，本研究对德氏乳杆菌保加利亚亚种与多种常见病原菌进行共培养实验，结果发现，在普通环境及厌氧环境下德氏乳杆菌保加利亚亚种对包括金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌等在内的多种常见病原菌均表现出明显的抑制作用。该研究结果与JEBUR[17]探究嗜酸乳杆菌对烧伤感染常见病原菌抑制作用的结果相近。由于德氏乳杆菌保加利亚亚种与嗜酸乳杆菌同为乳杆菌属，因此，JEBUR[17]的研究结果对本研究起到一定辅证作用。而BOYANOVA等[12]初步探究出德氏乳杆菌保加利亚亚种的抗幽门螺杆菌活性，也对本研究结果起到一定的补充作用。

本研究还对德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物的抑菌效果进行探究，通过牛津杯试验观察各组抑菌圈直径大小以评估其抑菌作用。结果发现，德氏乳杆菌保加利亚亚种的发酵产物具有抑菌活性，且发酵产物中德氏乳杆菌保加利亚亚种的存在对抑菌效果的影响不大，但将48 h发酵产物的pH值调到7.2时其抑菌活性基本消失，表明发酵产物中的抑菌活性物质可能只能在酸性环境中发挥其抑菌活性。

ARIEF等[18]、RUZ等[19]的研究结果表明，乳酸菌产生的细菌素能够抑制金黄色葡萄球菌、淋球菌等，即乳酸菌代谢产物中的细菌素具有明显的抑菌作用。为了明确德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物抑菌成分，本研究对发酵产物中的抑菌活性物质进行了初步探究。德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物中的乳酸与其抑菌作用无关；以75%乙醇对德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物进行沉淀后检测其抑菌活性，结果表明乙醇沉淀物失去抑菌活性，但乙醇沉淀后的上清液仍具有对病原菌的抑制作用；以80%饱和度硫酸铵对德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物进行盐析，发现盐析沉淀物亦不具备对病原菌的抑制作用，表明该抑制物质不能被80%饱和度硫酸铵盐析沉淀。将德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物经相对分子质量3×103及10×103的超滤离心管超滤后的滤过液及上层液对铜绿假单胞菌仍具有明显的抑菌活性；利用截留相对分子质量为0.5×103的透析袋对德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物进行透析，透析袋外液体具有对病原菌的抑制作用，透析袋内的液体对病原菌无抑菌活性，表明德氏乳杆菌保加利亚亚种48 h发酵产物中的抑菌活性物质相对分子质量在0.5×103左右或以下。

随着抗菌药物在临床的广泛使用，细菌耐药也变得十分普遍，耐药菌、多重耐药菌及泛耐药菌的感染已成临床十分棘手的问题。微生物组学研究的广泛开展，使科研人员意识到可以利用微生物之间的相互作用开发新的抗感染策略，益生菌特别是乳酸菌由于其独特的性质成为拮抗病原微生物的重要候选菌。本文研究结果为开发抗微生物感染的益生菌制剂提供了有力实验支持。本课题后续在动物水平研究德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵产物对烧伤并发铜绿假单胞菌感染的治疗效果研究目前正在进行中，有望为烧伤并发铜绿假单胞菌感染的治疗提供依据和新思路。