lncRNA HOTAIR和lncRNA UCA1在肾上腺恶性肿瘤中的表达及临床意义*

孙青风，杜学谦，王晓鹏，郭岩松，梅向楠，姜利宁

(1.河北省沧州市人民医院泌尿外科，河北沧州 061001；2.河北省沧州市中心医院泌尿外科，河北沧州 061001)

肾上腺肿瘤是泌尿外科常见肿瘤，肾上腺本身的组织学特性和解剖学特点导致其容易被漏诊或误诊[1]。大量研究显示，长链非编码RNA(lncRNA)在多种肿瘤中均有异常表达，提示其与多种肿瘤的发生、发展关系密切[2]。HOX转录反义RNA(HOTAIR)是首个被发现的具有反式转录调控基因表达的lncRNA，在肝癌、结直肠癌等癌症的增殖、浸润、转移中发挥作用[3]。尿路上皮癌相关基因1(UCA1)是与泌尿系统相关的lncRNA，最早发现于膀胱移行细胞癌中，同时在结直肠癌、膀胱癌等癌症中存在不同程度的高表达[4]。但上述2种lncRNA在肾上腺肿瘤中的表达和临床意义缺少相关报道，为探究lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1在肾上腺肿瘤中的作用机制，本研究采用实时荧光定量(qPCR)检测肾上腺癌患者组织中HOTAIR、 UCA1的相对表达水平，分析其相对表达水平与临床病理的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 组织标本为2016年6月至2019年6月在沧州市人民医院及沧州市中心医院行手术切除的52例肾上腺癌患者肾上腺癌及配对癌旁组织标本。所有患者在术前均未接受射频消融、放疗、化疗等治疗，肾上腺癌组织标本经病理切片证实含80%以上癌细胞，癌旁组织取自距肾上腺癌组织超过2 cm处，经病理切片证实无癌细胞。标本组织切除后15 min以内置入液氮中冷冻，-80 ℃保存备用。本研究经医院伦理委员会审核批准，52例肾上腺癌患者均知情同意且签署知情同意书。所有患者临床资料完整，其中男31例，女21例；年龄34～79岁，平均(55.10±6.32)岁；国际抗癌组织(UICC)TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期19例，Ⅲ期16例，Ⅳ期6例。

1.2仪器与试剂 SP-756P紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，ABI 2720 PCR仪(美国应用生物系统公司)，ABI 7500型实时荧光定量PCR系统(美国应用生物系统公司)，ABI life 2720 PCR热循环仪(美国应用生物系统公司)，GenoSens 1860凝胶成像分析系统(上海勤翔科学仪器有限公司)，德国SIGMA1-14小型台式高速离心机(德国Sigma公司)，Trizol RNA提取试剂盒(北京英格恩生物有限公司)，miRNA反转录试剂盒(美国应用生物系统公司)，miRNA qPCR检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)，其他常规试剂、仪器及实验耗材均由医院实验室提供。

1.3方法 取100 mg冻存组织以Trizol法提取组织总RNA，操作步骤同试剂盒说明书。使用紫外可见分光光度计测定提取RNA的吸光值，并测定浓度。按照miRNA反转录试剂盒所示操作步骤反转录得到cDNA，-20 ℃备用。取cDNA进行qPCR检测HOTAIR和UCA1表达水平。lncRNA HOTAIR正向引物5′-3′:GGTAGAAAAAGCAACCACGAAG；反向引物3′-5′:ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGC。内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)正向引物5′-3′:AGGACATGCATGGACACAGA；反向引物3′-5′:GGACGGAATCAACTCTGACA。反应条件：95 ℃ 5 s，85 ℃ 10 s，60 ℃ 25 s，共40个循环；lncRNA UCA1正向引物：5′-ACGCTAACTGGCACCTTGTT-3′；反向引物：5′-TGGGGATTACTGGGGTAGGG-3′。GAPDH正向引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；反向引物：5′-GAAGATGGTGGGATTTC-3′。反应条件：90 ℃ 10 s，65 ℃ 20 s，75 ℃ 10 s，共45个循环。根据PCR扩增曲线得到Ct值，使用2-ΔΔCt法分析lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1基因相对表达水平。ΔCt=CtHOTAIR-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt癌组织-ΔCt癌旁组织，UCA1同上。根据lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1基因相对表达水平是否超过相对表达水平平均值，将肾上腺癌组织分为lncRNA HOTAIR高表达组、lncRNA HOTAIR低表达组及lncRNA UCA1高表达组、lncRNA UCA1低表达组。

2 结 果

2.1lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1在不同组织中的相对表达水平比较 肾上腺癌组织中lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1相对表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)，见表1。

表1 lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1在不同组织中的相对表达水平比较

2.2lncRNA HOTAIR在肾上腺癌组织中的相对表达水平与临床病理特征的关系 对52例肾上腺癌患者癌组织中lncRNA HOTAIR相对表达水平与临床病理特征进行分析后发现，lncRNA HOTAIR相对表达水平与肿瘤最大径、远处转移、TNM分期有关(P<0.05)，肿瘤最大径大、发生远处转移、TNM分期晚的患者lncRNA HOTAIR相对表达水平增高；lncRNA HOTAIR相对表达水平与性别、年龄、单发或多发、包膜浸润、分化程度无关(P>0.05)。见表2。

表2 lncRNA HOTAIR在肾上腺癌组织中的相对表达水平与临床病理特征的关系[ n(%)]

2.3lncRNA UCA1在肾上腺癌组织中的相对表达水平与临床病理特征的关系 对52例肾上腺癌患者癌组织中lncRNA UCA1相对表达水平与临床病理特征进行分析后发现，lncRNA UCA1相对表达水平与肿瘤最大径、远处转移、包膜浸润、TNM分期有关(P<0.05)，肿瘤最大径大、发生远处转移和包膜浸润、TNM分期晚的患者lncRNA UCA1相对表达水平显著增高；lncRNA HOTAIR相对表达水平与性别、年龄、单发或多发、分化程度无关(P>0.05)。见表3。

表3 lncRNA UCA1在肾上腺癌组织中的相对表达水平与临床病理特征的关系[ n(%)]

3 讨 论

肾上腺是人体最重要的内分泌腺体之一，分泌皮质醇类、儿茶酚胺类、醛固酮类等多种具有重要调节功能的激素[5]。遗传、基因突变等原因能够导致肾上腺癌变，由于患者可表现为不同类型的临床症状和体征，诊断难度显著提高。随着影像学技术的不断发展和应用，肾上腺癌诊断成功率大幅增加，但是该病起病隐匿，早期缺乏特异性症状，尤其是恶性嗜铬细胞瘤，其症状、体征、影像学检查、实验室检查等方面检查结果均与肾上腺良性肿瘤相似[6]，多数肾上腺癌患者一般发现已经处于中晚期，已经失去最佳治疗时机，且中晚期患者治疗效果不佳，复发率高，易发生转移，5年生存率较低[7]。因此，早期诊断和治疗对于肾上腺癌患者意义重大。癌症属于多因素、多阶段发生、发展的疾病，目前对于肾上腺癌的确切发病机制尚未完全明确。肿瘤抗原和异位激素是目前常用的肿瘤标志物，然而传统的肿瘤标志物存在灵敏度和特异度不高，漏诊和误诊概率较大等不足。寻找一个肿瘤早期诊断、预后判断及治疗的新的分子标志物是临床研究的热点。

lncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子[8]，自身缺乏编码蛋白的能力，定位于细胞核和/或细胞质[9]。最初缺乏对lncRNA数量、种类和功能的了解，将其称之为基因组转录的“噪音” “暗物质” “垃圾DNA”等[10]。随着对lncRNA的研究不断深入，研究显示其广泛参与多种生物学过程，并能够通过信号、分子诱饵、支架、导向等多种机制调控下游靶基因的表达[11]。研究表明，lncRNA在肿瘤发生及进展的过程中扮演着重要的角色，已经成为新的肿瘤标志物的关注焦点[12-13]。

HOTAIR是一种与肿瘤发生密切相关的lncRNA，其DNA序列位于人类第12号染色体H0xC11基因与H0xC12基因之间[14]。HOTAIR与多种肿瘤的发生与发展存在密切联系，周怿等[15]研究发现其在胃癌患者病灶中的表达上调，张蔚等[16]研究发现其在妇科癌症组织中的表达显著高于正常组织，但在肾上腺癌中的表达研究较少。本研究显示，肾上腺癌组织中lncRNA HOTAIR相对表达水平显著高于正常癌旁组织，且lncRNA HOTAIR高表达与肿瘤最大径、远处转移、TNM分期有关，提示lncRNA HOTAIR能够促进肾上腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。UCA1也是一种lncRNA，在膀胱癌、黑色素瘤、结肠癌等恶性肿瘤中被证实表达异常[17-18]。有研究认为，UCA1可以通过mTOR-STAT3 通路或抑制miR-143上调HK2的表达参与糖代谢的调节[19]。本研究证实，lncRNA UCA1在肾上腺癌组织中高表达，且与肿瘤最大径、远处转移、包膜浸润、TNM分期有关，提示UCA1与肾上腺癌的发生、发展存在一定的关系，可能能够作为肾上腺癌生物标志物，为后续的研究提供一定的试验基础。

4 结 论

lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1在肾上腺癌患者癌组织中表达上调，其相对表达水平与肿瘤大小、转移和分期有关，可能成为肾上腺癌诊断和治疗新的分子标志物。检测lncRNA HOTAIR、lncRNA UCA1在肾上腺癌患者癌组织中相对表达水平有助于肾上腺癌的早期诊断、预后判断及治疗，但尚需更多样本量的临床研究证据对本结论予以佐证。