高效液相色谱-荧光检测法快速检测植物油中的辣椒素和二氢辣椒素

吴 娟，汤见平，薛元强，严中和，胡志雄，3，齐玉堂，3，张维农，3

(1.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉 430023; 2.中粮新沙粮油工业(东莞)有限公司，广东 东莞 523147； 3.湖北省油脂精细化工工程技术研究中心，武汉 430023)

辣椒素和二氢辣椒素是辣椒中的活性成分，占总辣椒碱的90%以上，是辣椒中辣味的主要来源[1-2]。由于饮食习惯及口味爱好，辣椒在我国使用量较大，使用范围较广。正常食用植物油中不存在辣椒素或二氢辣椒素，然而接触过辣椒的餐厨废弃油脂难以避免地含有这类成分，因此辣椒碱类成分可作为鉴别餐厨废弃油脂的特征指标[3]，相关的检测方法亦受到广泛关注。

目前，对于植物油中辣椒素、二氢辣椒素的检测方法主要有高效液相色谱串联质谱法、免疫分析法和基于光谱技术的检测方法等。赵琴[4]、赵灿方[5]、梁桂娟[6]、Wang[7]等建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱检测食用油和地沟油中的辣椒素和二氢辣椒素的方法，将样品预处理后，经过固相萃取柱富集辣椒碱，再用解吸液洗脱，然后用高效液相色谱分离目标物，并串联三重四级杆质谱进行定量分析。免疫分析法主要有时间分辨荧光免疫层析法、酶联免疫吸附法、胶体金法。杨青青[8]建立了一种辣椒素物质时间免疫层析分析方法；李培武等[9]提供了辣椒素人工半抗原、人工抗原的制备方法，由此得到的人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的辣椒素抗体，可用于食用植物油中辣椒素的免疫检测。Liu等[10]建立了一种表面增强共振拉曼散射方法来检测辣椒素，并通过分子衍生化处理来识别非法食用油。

高效液相色谱串联质谱检测辣椒素有很高的灵敏度，但是仪器昂贵，需要专业的技术人员操作和维护，一般油脂企业和实验室无力装备。免疫分析法和基于光谱技术的检测方法效率较高，但是免疫分析法中辣椒素抗原的制备较为困难，基于光谱技术的检测方法灵敏度相对较低。因此，建立一种检出限低、操作简便且成本低的检测方法尤为重要。本文依据辣椒素和二氢辣椒素分子结构中均含有酚羟基，利用相似相溶原理，选择甲醇为萃取溶剂一步萃取植物油中的辣椒素和二氢辣椒素，并优化前处理条件，建立了一种高效液相色谱-荧光检测方法。该方法能在一定程度上降低检测成本。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

实验用植物油，购于当地超市；辣椒素(98%)、二氢辣椒素(98%)，百灵威科技有限公司；色谱级甲醇、乙腈、乙醇，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；HJ-4型多头磁力加热搅拌器，金坛市荣华仪器制造有限公司；YRE2000E旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司；SHZ-Ⅲ型循环水泵，上海亚荣生化仪器厂；JHX280H旋涡混合仪，北京京辉凯业科技有限公司；SB3200型超声双频清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Cary Eclipse型荧光分光光度计，美国瓦里安仪器有限公司；1260型安捷伦高效液相色谱仪(配G1311C四元泵、G1321B荧光检测器、G1316A柱温箱)，安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

取30 g油样(精确到0.01 g)于100 mL离心管中，加入一定量的萃取溶剂，在磁力搅拌器上萃取一定时间后，以3 000 r/min离心5 min。取上层澄清溶液(若非萃取1次，可将离心后的沉淀于上述相同条件下萃取、离心，合并上层澄清溶液)于圆底烧瓶中，在40℃下旋蒸浓缩至干。然后用2 mL萃取溶剂复溶，用0.22 μm有机滤膜过滤后进高效液相色谱仪检测。

1.2.2 高效液相色谱检测条件

VenusilASB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为甲醇-超纯水(体积比70∶30)，流速0.7 mL/min；柱温30℃；进样量10 μL；激发波长280 nm，发射波长312 nm。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 标准曲线的绘制

以甲醇为溶剂，分别配制0.125、0.250、0.500、1.000、2.500 mg/L辣椒素、二氢辣椒素的标准溶液，按照1.2.2条件进行高效液相色谱-荧光检测。以标准溶液的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得出辣椒素、二氢辣椒素的线性回归方程。

1.2.3.2 加标回收率实验

分别在空白油样中加入不同量的辣椒素与二氢辣椒素标准溶液，配制成12.5、25.0、50.0 μg/kg 3种不同含量的混标加标油样，按照优化的样品前处理方法萃取样品中的辣椒素和二氢辣椒素，然后采用高效液相色谱仪检测，根据测得的峰面积和标准曲线回归方程计算加标回收率。

1.2.3.3 精密度实验

分别配制80.0、50.0、12.5 μg/L 3种不同质量浓度的辣椒素与二氢辣椒素标准溶液，每种标准溶液分别在同一天采用高效液相色谱仪测定5次，连续测定5 d。根据测得的峰面积，经标准曲线回归方程计算后评价实验的精密度。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

以辣椒素和二氢辣椒素加标后含量均为100 μg/kg的30 g油样为样品，对其前处理条件进行优化，每组优化选择均进行两次平行实验。

2.1.1 萃取溶剂的选择

分别以甲醇、乙腈、乙醇为萃取溶剂，在萃取溶剂体积30 mL、萃取次数1次、萃取时间10 min条件下，考察不同萃取溶剂对辣椒素、二氢辣椒素回收率的影响，结果见图1。

图1 萃取溶剂种类对回收率的影响

由图1可知，甲醇作为萃取溶剂时，辣椒素和二氢辣椒素的回收率分别为85.83%、80.52%，乙腈萃取时辣椒素和二氢辣椒素的回收率分别为71.54% 和65.97%，乙醇萃取时辣椒素和二氢辣椒素的回收率分别为61.63%和61.59%，可见甲醇萃取回收率最高。因此，选择萃取溶剂为甲醇。

2.1.2 萃取溶剂体积的确定

在甲醇为萃取溶剂、萃取次数1次、萃取时间10 min条件下，加入不同体积的萃取溶剂进行萃取，考察萃取溶剂体积对萃取效果的影响，结果见图2。

图2 萃取溶剂体积对萃取效果的影响

由图2可知，随着萃取溶剂体积的增加，辣椒素和二氢辣椒素的峰面积也逐渐增加，当萃取溶剂体积增加到30 mL时，辣椒素和二氢辣椒素的峰面积趋于平稳。考虑到使用100 mL离心管的便捷性，以及样品检测时不必要的损耗，选择最佳萃取溶剂体积为30 mL。

2.1.3 萃取次数的确定

在甲醇为萃取溶剂、萃取溶剂体积30 mL、萃取时间10 min条件下，分别萃取不同次数，考察萃取次数对萃取效果的影响，结果见图3。

由图3可知，萃取次数由1次增加到2次，辣椒素与二氢辣椒素的峰面积变化较为显著，约增加了10%，而继续增加萃取次数，辣椒素与二氢辣椒素峰面积变化不大。考虑到检测效率，选择最佳萃取次数为2次。

图3 萃取次数对萃取效果的影响

2.1.4 萃取时间的确定

在甲醇为萃取溶剂、萃取溶剂体积30 mL条件下，萃取不同时间，再重复萃取1次，考察萃取时间对萃取效果的影响，结果见图4。

图4 萃取时间对萃取效果的影响

由图4可知，萃取时间由5 min延长到10 min，辣椒素与二氢辣椒素的峰面积稍有增加，约增加了1.5%，随着萃取时间的继续延长，辣椒素与二氢辣椒素的峰面积变化不大。从尽可能提高样品中辣椒素、二氢辣椒素萃取率角度出发，选择10 min作为最佳萃取时间。

综上，样品前处理优化条件为：油样30 g，甲醇为萃取溶剂，萃取溶剂体积30 mL，萃取时间10 min，萃取次数2次。

2.2 方法学考察结果

2.2.1 标准曲线

按1.2.3.1方法，以标准溶液的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程，见表1。

表1 标准曲线回归方程

由表1可知，在0.125～2.500 mg/L质量浓度范围内，辣椒素与二氢辣椒素的线性相关系数均大于0.999，表明线性关系良好。此外，以3倍信噪比计算得到辣椒素与二氢辣椒素的检出限均为5 μg/kg，而地沟油中辣椒碱的含量一般高于600 μg/kg[11]，因此该方法可以应用于地沟油的检测。

2.2.2 加标回收率

按1.2.3.2方法，考察样品加标回收率，结果见表2。

表2 加标回收率实验结果

由表2可知：3种加标样品辣椒素的回收率在81.08%～96.80%之间，相对标准偏差(RSD)在2.02%～11.00%之间；二氢辣椒素的3种加标样品的回收率在99.27%～100.28%之间，相对标准偏差在0.26%～7.72%之间。

2.2.3 精密度

按1.2.3.3方法，考察检测方法的精密度，日内和日间精密度实验结果分别见表3、表4。

表3 日内精密度实验结果(n=5)

表4 日间精密度实验结果(n=5)

由表3可知，日内辣椒素重复测量的准确度在91.12%～97.66%之间，相对标准偏差在0.18%～1.92%之间，二氢辣椒素的准确度在95.74%～96.65%之间，相对标准偏差在0.67%～0.78%之间。由表4可知，连续5 d辣椒素重复测量的准确度在88.27%～96.40%之间，相对标准偏差在0.61%～2.48%范围内，二氢辣椒素的准确度在93.66%～97.60%之间，相对标准偏差在0.55%～5.14%之间。通过对3种不同质量浓度辣椒素、二氢辣椒素标准溶液的日内、日间实验，样品的准确度均不低于88.27%，相对标准偏差不高于5.14%，综合说明该实验方法具有良好的重现性、准确度和精密度。

3 结 论

本文结合高效液相色谱-荧光检测，建立了一种植物油中辣椒素和二氢辣椒素的检测方法。在甲醇为萃取溶剂、萃取溶剂体积30 mL、萃取次数2次、每次萃取时间10 min条件下，加标样品回收率均在81.08%以上，辣椒素和二氢辣椒素的检出限均为5 μg/kg，可以应用于食用油或非食用油中辣椒素、二氢辣椒素的检测，为检测地沟油提供了一种新方法。