竹鼠细小病毒NS1 基因序列测定与分析

何奇松，闭璟珊，李广平，文 明，蒋先彪，秦建有，周庆安，熊 毅，马 琳※

(1.广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西 南宁 530001；2.广西恭城瑶族自治县动物疫病预防控制中心，广西 恭城 542599；3.广西阳朔县动物疫病预防控制中心，广西 阳朔 541900)

目前国内外关于竹鼠病毒性疾病的研究和报道较少，临床上也没有针对竹鼠病毒性疾病防治的相关措施，因此，对竹鼠开展相关病毒性疾病的研究对竹鼠疾病的防治具有重要意义。细小病毒（Parvovirus）是自然界中存在的最小的DNA 病毒之一，是一种无囊膜单链DNA 病毒，其基因组大约5 kb[1-2]。细小病毒可以感染哺乳动物（猪、牛和犬等）、禽类、节肢动物（虾等）、昆虫等50 多种生物[3]。根据所感染的宿主类型可以分为细小病毒亚科及浓核病毒亚科。细小病毒亚科进一步可以分成8个属，即阿留申病毒属、禽细小病毒属、博卡病毒属、依赖病毒属、红病毒属、细小病毒属、四型病毒属以及复制病毒属[3]。其中，猪细小病毒1 型、犬细小病毒、水貂肠炎病毒等均能引起宿主产生严重的病理变化、且传染性强，给养殖业带来巨大经济损失[4]。细小病毒的病毒粒子无囊膜，不含糖类及脂质，结构坚实致密，对外界环境具有很强的抵抗力，病毒可在粪便及固体污染物中存活数月至数年。因此，动物养殖场一旦感染细小病毒，想要通过消毒来彻底杀灭病毒是很难的。竹鼠养殖具有需要场地小，污染少，容易上手等优点，曾被政府列为扶贫项目[5]。竹鼠抵抗力较强，在研究人员实地走访的多个养殖场（户）中得知，竹鼠的主要疫病集中在腹泻方面，也给竹鼠养殖造成了不小的经济损失[6]。目前，我国对竹鼠常见疾病的调查及研究资料十分有限[7-11]，本文通过对竹鼠腹泻病例的诊断和竹鼠细小病毒序列分析，为我国竹鼠病毒流行病学研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验病料为2019年初广西某竹鼠养殖规模场送检的发病竹鼠组织样品。动物组织DNA 抽提试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒及DL2000 DNA Marker 等购自天根生化科技有限公司，Ex taqDNA 聚合酶、pMD18-T 载体、内切酶Hind III 和EcoR I 及大肠杆菌DH5 感受态细胞等购自宝生物工程有限公司。

1.2 引物设计和合成

参考Genbank 公布的细小病毒NS1 基因序列，用Premier 5.0 和Oligo 6.0 软件设计一对特异引物扩增竹鼠细小病毒的NS1 基因，引物由宝生物工程有限公司合成，具体引物序列见表1。

表1 引物序列Table.1 Sequences of the primers

1.3 模版的提取及扩增

根据DNA 抽提试剂盒按说明书步骤提取模版，以提取后的DNA 为模板，用引物A1/A2 进行NS1基因克隆。扩增体系为：模板DNA 5.0L，Premix Taq 12.5L，引物A1、A2 各1.0L，用ddH2O 加至25.0L。扩增程序：95℃3 min；94 ℃60 s，55 ℃50 s，72 ℃60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。用凝胶电泳检测PCR 扩增产物。

1.4 产物的回收及鉴定

按胶回收试剂盒说明书步骤对扩增产物的目的片段进行回收纯化，与pMD18-T 载体连接后，转化至DH5 感受态细胞，用玻璃棒均匀涂板，过夜培养，挑取白色菌落在LB 培养基上进行扩大培养，然后提取质粒，对质粒进行酶切和PCR 鉴定，阳性质粒送至宝生物工程有限公司测序。

1.5 NS1基因序列分析

用Lasergene DNASTAR 7.1 软件中MegAlign 程序对目的基因序列与GenBank 上的细小病毒NS1 基因核苷酸序列进行同源性比对分析，其中参考序列包括竹鼠细小病毒代表毒株（GenBank No.MF497824、GenBank No.MF497825）、国内蝙蝠细小病毒代表毒株（GenBankNo.KJ641666）、牛细小病毒代表毒株（GenBank No.M14363）、犬细小病毒代表毒株CPV（GenBank No.M19296）、猫细小病毒代表毒株（GenBankNo.EU659111）、鹅细小病弱毒疫苗株（GenBank No.KC996729）、番鸭细小病毒代表毒株（GenBank No.KM093740）、水貂细小病毒代表毒株（GenBank No.D00765）、老鼠细小病毒代表毒株（GenBank No.U12469）、猪细小病毒弱毒株（GenBank No.NC001718）、浣熊细小病毒代表毒株（GenBank No.JN867610）及人类细小病毒毒株（Gen-Bank No.NC000883），并绘制遗传进化树。

2 结果和分析

2.1 NS1基因扩增和鉴定结果

用凝胶电泳检测扩增产物，结果在1000bp处出现特异性目的带（见图1），与扩增片段预期结果相符。重组质粒用EcoRⅠ及Hind Ⅲ双酶切，也得到1000 bp的目的带（见图2）。将阳性重组质粒送至宝生物工程有限公司进行测序，确定NS1 基因片段的大小为1000 bp。

图1 NS1 基因片段的PCR 电泳图Fig.1 Electrophoretogram of NS1 amplified by PCR

图2 NS1 基因片段的酶切电泳图Fig.2 Electrophoretogram of NS1 digested by enzyme

2.2 同源性分析结果

将测序所得的2 株细小病毒NS1 基因序列（分别将其命名为1-XQ 和3-ZQ）利用NCBI 中的Blast 进行比对分析，结果显示为细小病毒。应用Lasergene DNASTAR 7.1 软件中的MegAlign 程序 将1-XQ、3-ZQ 与GenBank 上收录的细小病毒序列进行比较分析（见图3）。结果显示，本实验中，2 株细小病毒NS1基因序列（1-XQ，3-ZQ）核苷酸同源性为99.9%；与另外两株广西竹鼠细小病毒分离株（MF497824、MF497825）的核苷酸同源性分别为96.8%～97.5% 和96.9%～97.6%；与蝙蝠细小病毒（KJ641666）的同源性较高，为98.9%～99.0%；与老鼠细小病毒（U12469）的同源性为87.3%～87.6%；与犬细小病毒（M19296）的同源性为67.7%～68.6%、与猫细小病毒（EU659111 的同源性为69.0%～69.9%；与水貂细小病毒（D00765）的同源性为67.1%～68.5%；与猪细小病毒（NC001718）的同源性为64.8%～64.9%；与浣熊细小病毒（JN867610）的同源性为67.8%～68.6%；与牛、鹅、番鸭、人类等其他种类细小病毒核苷酸同源性较低，为31.8%～41.6%。

2.3 NS1基因遗传进化树

应用软件MegAlign 6.0 分析实验测序得到的2株竹鼠细小病毒株序列与参考毒株的亲缘性和进化关系，并构建遗传进化树（见图4）。结果显示本次检测到的竹鼠细小病毒1-XQ 和3-ZQ 株与广西竹鼠分离毒株（MF497824、MF497825）、中国分离到的蝙蝠毒株（KJ641666）亲缘关系最近，属于同一分支，而与牛、鹅、番鸭以及人类等其他种类细小病毒核苷酸序列遗传进化关系较远。

图3 1-XQ、3-ZQ 与参考毒株NS1 基因核苷酸序列的同源性比较Fig.3 Homology comparison on nucleotide of NS1 gene among 1-XQ、3-ZQ strain and reference strains

图4 基于NS1 基因片段核苷酸遗传进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of NS1

3 讨论

本实验通过PCR 方法确诊患病竹鼠感染了细小病毒，经过测序分析、核苷酸同源性比较和遗传进化树分析，2 株毒株与我国境内的蝙蝠细小病毒株核苷酸同源性最高为98.9%～99.0%，亲缘关系最为接近，说明该场竹鼠极有可能是通过蝙蝠而感染细小病毒。该2株毒株与广西已发现的两株毒株GX04、GX05 核苷酸同源性分别为96.8%～97.5%和96.9%～97.6%，说明广西流行的竹鼠细小病毒毒株同源性较高，推测他们可能有共同祖源。该场虽在两个不同月份都检测出细小病毒，但无传染性，都是零星发病，且无明显季节性。

目前，对竹鼠免疫系统以及竹鼠感染细小病毒致病机理的研究还很少，只是从广大养殖户口中得知竹鼠甚少感染传染病，发病大多集中在腹泻和牙齿上，这是否是由于竹鼠自身的免疫系统功能强大，还是竹鼠细小病毒致病性较弱，还需要进一步的研究。

近年来，新发传染性疾病给全世界公共卫生带来极大威胁，人类新发传染病中有60%～80%来源于野生动物[12]，竹鼠是我国南方省区分布较广的野生动物，也属哺乳动物的一员，吸血节肢动物可以通过叮咬的途径将其携带的病毒传播给人类。因此，积极监测竹鼠及其他野生动物中的病毒性感染情况，不仅对野生动物疾病的防治具有重要意义，还能为早期预警和防控其向人类传播提供科学依据，进一步维护人类的公共卫生安全。

4 结论

1-XQ、3-ZQ 毒株与广西竹鼠细小病毒分离株及国内蝙蝠细小病毒分离株亲缘关系最近，属于同一分支。