氧化苦参碱对哮喘小鼠肺组织MUC5AC表达的影响

兰露莎 赵兵兵 陈强 杨红宇

摘要：目的：探讨氧化苦参碱对哮喘小鼠肺组织的MUC5AC和TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13因子表达的影响。方法：用Al（OH）3和卵清白蛋白诱发BALB/c小鼠过敏性哮喘，哮喘模型建立后，予氧化苦参碱或地塞米松进行治疗，分别在治疗后第5、15天处死部分小鼠，留存血清、支气管肺泡灌洗液和肺组织进行检测。采用ELISA法检测血清和支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13因子的含量，qRT-PCR、免疫组化法、免疫印迹法检测肺组织MUC5AC的mRNA和蛋白质表达情况。结果：在治疗后第5天和第15天时，氧化苦参碱治疗组或氧化苦参碱和地塞米松联合治疗组血清或支气管肺泡灌洗液的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13含量均较哮喘组降低（P<0.01或P<0.05）;哮喘组肺组织TLR4的mRNA和蛋白表达与正常组无差异，MUC5AC的mRNA和蛋白表达较正常组显著增高，氧化苦参碱治疗组或氧化苦参碱和地塞米松联合治疗组可上调TLR4的mRNA和蛋白表达，下调MUC5AC的mRNA和蛋白表达，以氧化苦参碱和地塞米松联合治疗组显著（P<0.01）。结论 氧化苦参碱可通过上调TLR4的表达调节小鼠的免疫应答，下调TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13因子的表达或含量减轻哮喘小鼠的气道炎症反应，通过下调MUC5AC的表达控制哮喘小鼠气道粘液过度分泌，且与地塞米松联合使用该作用更显著。

关键词：氧化苦参碱;哮喘;MUC5AC;TLR4;小鼠

前言

氧化苦参碱（Oxymatrine， OMT）是从豆科属植物苦参或平科植物广豆根中分离出来的生物碱， 又名苦参素。它的化学分子式为C15H24N2O2，具有四环的喹嗪啶类结构， ， ，易溶于水，分子量为264，无色结晶。由于氧化苦参碱的广泛临床应用，对其药理作用及作用机制的研究也越来越引起相关医药学者的极大兴趣。近年来，大量研究表明氧化苦参碱具有利尿、抗病原体、免疫作用等广泛的药理作用[1， 2，]，显现出具有新用途开发的意义。近年研究显示，氧化苦参碱在哮喘的治疗上有显著疗效，能抑制气道炎症及抗气道高反应性等作用，但机制不详。

本研究通过建立过敏性哮喘小鼠模型，小鼠气道粘蛋白MUC5AC基因和蛋白表达情况的观察，深入探讨OMT对哮喘模型小鼠哮喘的干预机制，为民族药开拓新的药理作用。

1 材料

1.1 BALB/c小鼠，雌性，4-6周龄，SPF级（合格证号SYXK（黔）2012-001），购自贵州省实验动物工程中心，生产許可证号SCXK（黔）2012-001。

1.2 试剂和试剂盒：2% Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant，购自InvivoGen公司（Lot #5113）， 卵清白蛋白（Albumin from chicken egg white， OVA），购自sigma公司（批号1001988500），注射用地塞米松磷酸钠，购自马鞍山丰原制药有限公司（批号150512-1）。氧化苦参碱（纯度99.0%），购自中国药品生物检定所，为国家药品标准物质，批号110780-201007。小鼠TNF-α（JEM-12）、IL-4（JEM-04）和 IL-5（JEM-03）定量分析酶联免疫检测试剂盒，购自安徽巧伊生物科技有限公司小鼠IL-13定量分析酶联免疫检测试剂盒，购自联科生物科技有限公司（221341235）。动物组织总RNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司（#03901），Prime ScriptTM RT reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，购自TAKARA BIO INC.。BCA 蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物有限公司。兔抗MUC5AC多克隆抗体、兔抗GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG 抗体购自博士德生物工程有限公司。GTVisionⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒，基因科技（上海）有限公司。PVDF购自美国Millipore公司，PAGE电泳试剂、ECL 发光液购自美国BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 哮喘小鼠模型的建立及实验分组 根据文献的方法并予以改进建立哮喘模型：第1、8、15天腹腔注射OVA及氢氧化铝凝胶混合液0.2ml（内含OVA60?g及2.25mg氢氧化铝凝胶）致敏;第21天开始用5%OVA溶液8ml行超声雾化，每次30min，连续雾化5天进行激发。正常对照组用生理盐水代替OVA进行致敏和雾化。54只SPF级BALB/c小鼠，雌性，4-6周龄，随机分为6组，每组9只：①CON组，用生理盐水代替OVA进行致敏和雾化，不给药;②AST组，按上述方法进行致敏和激发，不给药;③TRE组，按上述方法进行致敏和激发，于每次激发前30 min腹腔注射地塞米松（0.5mg/kg）;④OMT-H组，按上述方法进行致敏和激发，于每次激发前30 min腹腔注射OMT（25mg/kg/D）;⑤OMT-M组，按上述方法进行致敏和激发，于每次激发前30 min腹腔注射OMT（12.5mg/kg/D）;⑥OMT-L组，按上述方法进行致敏和激发，于每次激发前30 min腹腔注射OMT（6.25mg/kg/D）。于治疗后第5天处死小鼠3只/组，同时①摘眼球取血并制备血清冻存于-20℃;②从气管注射无菌NS 0.5ml入肺，抽吸3次后将抽出液体即支气管肺泡灌洗液（BALF）冻存于-20℃;③分别称小鼠体重和肺组织重量并记录;④取右下肺叶置于4%多聚甲醛中固定;⑤余下肺组织冻存于-80℃。各组小鼠不再激发，隔天给予相应药物1次，持续5次后，处死小鼠，留存标本及相应检查同前。

2.2血清及BALF中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量检测 根据试剂盒说明书方法进行，根据检测结果绘制标准曲线，计算各样品中指标因子的含量，制作柱形图。

2.3肺组织MUC5AC mRNA表达情况的检测 采用real time PCR法， MUC5AC上游引物5- ACACCGCTCTGATGTTCCTCACC-3，下游引物5- ATGTCCTGGGTTGAAGGCTCGT-3;GAPDH上游引物5- CATGGCCTTCCGTGTTCCTA -3，下游引物5- GCGGCACGTCAGATCCA -3。每个样品各取约20mg肺组织，参照说明书提取总RNA，逆转录合成cDNA。以2μL cDNA为模板行real time PCR检测。反应条件：预变性（95℃，30 s），PCR反应（Repeat 40，95℃，5 s;52℃，30s）。确定Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，记录各组的Ct值。分别以GDPDH为内参，计算各组样本中MUC5AC基因的表达量，并对表达量的比值（2-△△Ct）进行分析。

2.4免疫组织化学法检测肺组织MUC5AC蛋白的表达 常规方法制备肺组织石蜡切片，采用免疫组化SP法进行操作。阳性部位成棕褐色。采用Image-Pro Plus图像分析软件进行图像分析，取平均积分光密度值表示目的蛋白的表达水平。

2.5免疫印迹法检测肺组织MUC5AC蛋白的表达 试剂盒方法提取小鼠肺组织的总蛋白质和细胞核蛋白质，BCA法定量蛋白质，常规方法行SDS-PAGE电泳、转膜、杂交、显影，用QuantityOne软件分析曝光条带，各蛋白条带的灰度值与相应的GAPDH条带灰度值的比值进行半定量分析。

2.6 统计学方法 各组所得计量数据采用均数±标准差（）表示，用SPSS19.0软件处理数据，两组间均数比较用独立样本t检验。检验水准α=0.05，p<0.05有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量 在治疗后第5天和第15天时，AST组血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量均显著高于正常组，TRE组和OMT-H组的血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量显著下调（见图1，P<0.05）。

3.2 小鼠BALF中TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量 在治疗后第5天和第15天时，MOD组BALF中的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量均较正常组明显增高，TRE组和OMT-H和M组的血清的TNF-α、IL-4、IL-5和IL-13因子的含量下调（P<0.05）（见图2）。

3.3 小鼠肺组织MUC5AC mRNA的表达 qRT-PCR的结果显示，哮喘小鼠肺组织MUC5AC基因在治疗第5天或15天时较正常组均明显增高，而治疗TRE组和OMT各组可下调MUC5AC基因的表达（见图3）。

3.4 小鼠肺组织MUC5AC蛋白的表达 免疫组织化学结果显示，MUC5AC蛋白主要表达在支气管上皮细胞，存在于胞浆内，阳性染色表现为棕褐色颗粒。治疗5天或15天后，哮喘小鼠肺组织MUC5AC 蛋白表达明显高于正常组，而TRE组和OMT各组肺组织MUC5AC蛋白的表达较AST组减少（见图4A）。免疫印迹结果显示，哮喘小鼠肺组织MUC5AC 蛋白表达明显高于正常组，而TRE组和OMT各组肺组织MUC5AC蛋白的表达下调（P<0.05）（见图4B）。

4讨论

苦参当中含有大量的生物碱，其中含量最高的是苦参碱和氧化苦参碱。国内外大量的研究表明，苦参碱类化合物有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗病毒、免疫抑制、保肝利胆、抗寄生虫等多方面的药理作用[1，2]。氧化苦参碱因其具有特殊的氧结构，从而改变了药物分子的极性，也因此具有了比苦参碱更独特的作用机理和疗效[22]。氧化苦参碱的抗炎作用是其治疗哮喘的重要药理机制，它能起到抗炎、平喘的作用[3]。

近年来，随着对OMT研究的不断深入，其在呼吸系统方面作用也逐渐被人们重视[21]。支气管哮喘（简称哮喘）是全球范围内威胁公众健康的常见的慢性呼吸道炎症性疾病，全世界约有3亿人患哮喘[4，5]。炎症、重塑及粘液高分泌是支氣管哮喘的重要病理表现[23]。Toll样受体（Toll-like receptor， TLR）自1997年发现至今，已发现十余种，其中TLR4在哮喘气道慢性炎症的发生和维持中发挥重要作用，参与了哮喘炎症与气道重塑的病理过程和免疫应答[3]。TLR4通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应，最终诱导细胞因子合成与释放，介导肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素（IL）等炎性介质基因的表达，引起相应炎性介质的合成和释放[6，7]。气道粘液是一种具有粘附性和弹性的粘性胶，其中主要发挥功能的是粘蛋白（mucin，MUC），由气道杯状细胞分泌产生的粘蛋白MUC5AC表达和分泌增多被认为是气道粘液高分泌的分子学基础，反映了气道粘液分泌的情况[8，9，10]。

氧化苦参碱的药理作用广泛，初步显现出多种有新药开发意义的药理作用，但系统研究不够，在此方面的产品报道也较少，大多停留在研究阶段，希望能加强氧化苦参碱在医疗应用方面的产品研制和开发[11，12]。同时以氧化苦参碱的经典论述为指导，结合现代的研究方法，组织生命科学、化学、药学等多学科协作，展开有效物质基础、作用特点、作用机理等的综合研究，并将动物实验与临床实验相结合，动物实验能阐明药物的作用机制，同时也是进行临床实验的基础[13，14，17]。临床实验排除了安慰剂效应、疾病自限、向均数回归等现象的干扰，是检验氧化苦参碱临床疗效的最终手段[16，19]。若疗效可靠，则临床使用量迅速增长，故进一步加强对氧化苦参碱的研究具有重要的社会意义和巨大的经济效益[15，18，20]。

课题组前期的研究证实氧化苦参碱具有治疗哮喘的作用，但具体机制不清。因此本文通过对实验小鼠血清和支气管肺泡灌洗液中多种炎性介质的检测、肺组织中TLR4基因和蛋白表达情况的观察，以及粘蛋白MUC5AC基因和蛋白表达情况的观察，探讨氧化苦参碱对哮喘模型小鼠哮喘的干预机制，为民族药开拓新的药理作用。

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基金项目：贵州省科技厅省科技合作计划项目（黔科合LH字[2016]7369）

贵州省国家级、省级创新创业训练计划项目（DC 201710660036）

作者简介：兰露莎（1984-），女，硕士研究生，实验师，贵州医科大学实验动物中心.

通讯作者：杨红宇（1970-），男，高级实验师.