菌球形态与柠檬酸产量相关性研究

刘会 郑文瑶 孙小雯 郑之明

摘要    黑曲霉作为一种丝状真菌，其发酵过程中的菌丝形态对柠檬酸产量影响巨大。本文通过调控接种孢子浓度和摇床转速，对黑曲霉菌球形态和柠檬酸产量的相关性进行了研究。结果表明，菌球直径和致密度是至关重要的形态参数，将其控制在合适范围可显著提高柠檬酸产量。本研究为柠檬酸工业生产中黑曲霉菌株的代谢改造和过程调控提供了参考。

关键词    柠檬酸;黑曲霉;菌球形态;接种量;产量;相关性

中图分类号    TQ921+.1        文献标识码    A

文章編号   1007-5739（2020）20-0201-02                                                开放科学（资源服务）标识码（OSID）

柠檬酸作为全世界需求量最大的有机酸之一，广泛用于食品、化工、医药等行业[1]。黑曲霉是柠檬酸工业生产的主要菌种。作为一种丝状真菌，其发酵过程中的菌丝形态可呈现出离散菌丝、菌丝团和菌球3种截然不同的状态。大量研究表明，菌丝体形态是改变发酵液流变学性质并最终影响代谢产物合成的核心因素，对细胞代谢、发酵过程、产物积累及后续的分离提取均有显著影响[2-3]。因此，本文通过调控柠檬酸发酵中的初始接种孢子浓度和摇床转速，开展了黑曲霉菌球形态与柠檬酸发酵的相关性研究，以期为实际生产提供参考。

1    材料与方法

1.1    试验材料

1.1.1    供试菌株。黑曲霉chsC-3，由中国科学院强磁场与离子束物理生物学重点实验室保存。

1.1.2    产孢培养基。采用马铃薯（PDA）培养基。取300 g马铃薯去皮，称取200 g切成小块或削成片后放入锅中，加入1 000 mL水，煮沸后维持20～30 min。趁热用2层纱布过滤，弃滤渣。取滤液补水至1 000 mL，加入20 g葡萄糖和20 g琼脂，加热溶化，趁热分装，121 ℃高压灭菌20 min。

1.1.3    发酵培养基。采用玉米液化清液[4]。取200 g过60目筛的玉米粉，加入1 000 mL水，搅拌加热至60 ℃加入耐高温α-淀粉酶，90 ℃保温液化2 h，碘试呈棕色后液化结束。经110目滤布过滤后加入葡萄糖，使总糖浓度约17%。分装后，115 ℃高压灭菌20 min。

1.2    试验方法

将实验室保存的黑曲霉chsC-3菌株接种在含产孢培养基的试管斜面上，在36.5 ℃条件下培养7 d。刮取一定量的孢子置于含玻璃珠的无菌水中，旋转振荡将孢子打散，3层纱布过滤，制备成孢子悬液，用血球计数板计数。分别以5×103、5×104、5×105、5×106、5×107、5×108个/mL的浓度接种到含有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，摇床转速选取150、180、210、240、270、300 r/min 6个条件，36.5 ℃条件下培养3 d。

1.3    测定指标

使用Olympus TH4-200显微成像系统获取菌丝图像（放大100倍）。利用ImageJ软件对菌丝显微图像进行处理和分析，获得菌球直径、菌球核心面积和菌球投影面积等形态学参数。菌球致密度由核心面积除以投影面积的比值决定。总酸含量通过斐林试剂法进行检测。

2    结果与分析

2.1    接种量对菌球形态的影响

孢子接种量对发酵过程中的黑曲霉菌体形态影响显著。当接种量高于5×107个/mL时，黑曲霉菌体形态以离散菌丝或者缠绕的菌丝团为主，无法正常结球，致密度较低，发酵液黏度较大;当接种量为5×103～5×106个/mL时，黑曲霉发酵过程中的菌体均以菌球形态存在，且菌球直径与孢子浓度成负相关。当接种量为5×103个/mL时，菌球直径较大，致密度很高且菌球数目相对较少，究其原因可能是孢子碰撞形成晶核的概率受到孢子浓度的影响，接种量越小，孢子碰撞的概率也就越小，形成的晶核较少，菌球数目较少。当增大到5×104个/mL时，菌球直径变小，小于100 nm，形成晶核的概率增大，晶核数目明显增多，形成的菌球数目也明显增加。当接种量为5×105～5×106个/mL时，菌球直径进一步减小，致密度有所增加。

2.2    接种量对柠檬酸产量的影响

孢子接种量对柠檬酸产量的影响非常大。当接种量为5×103～5×108个/mL时，柠檬酸产量呈现先上升后下降的趋势。当接种量低于5×104个/mL时柠檬酸产量逐渐上升，进一步提高接种量，产酸降低;当接种量达到5×107个/mL时，产酸剧烈下降;当接种量继续增高至5×108个/mL时，产酸可忽略不计。

2.3    不同接种量下菌球形态与柠檬酸产量的相关性

从以上结果可以看出，孢子接种量对发酵过程中黑曲霉菌丝形态和最终的柠檬酸产量的影响巨大。以此为基础，进一步对菌球形态和柠檬酸产量的相关性进行分析。当接种量为5×103个/mL时，形成的黑曲霉菌球直径过大且非常致密，菌球内部细胞会受到挤压而导致分子扩散不能自由进行，菌球的中心区域会发生细胞自溶而变成空心，影响柠檬酸合成;当接种量增大到5×104个/mL时，菌球直径小于100 nm，且致密度适中，利于菌球内部及菌球和外部环境间氧气和营养物质的传输，是最利于产生柠檬酸的形态;当接种量继续增大时，虽然菌球直径仍然较小，但致密度有所增长，影响菌球内部的氧气和营养传输，产酸有所下降;当接种量高于5×107个/mL时，以离散菌丝或者菌丝团为主，发酵液黏度过大严重阻碍氧气和营养物质的传递，抑制柠檬酸合成。

2.4    不同摇床转速对菌球形态和柠檬酸产量的影响

黑曲霉发酵生产柠檬酸的过程是非常耗氧的，转速的变化不仅能够影响发酵液的溶氧，还会影响发酵液的混合效果及传能传质，另外还会对发酵过程中菌球的形成及形态产生影响。本研究选取150、180、210、240、270、300 r/min 6个摇床转速条件，通过研究不同转速对菌球形态和柠檬酸产量的影响，发现柠檬酸产量随着摇床转速的提高而不断增加，试验允许可设置的最高转速（300 r/min）最利于柠檬酸的积累，而且转速越高，形成的菌球数目增多，菌球直径变小，致密度增大。高转速不仅可以满足柠檬酸发酵过程对溶氧的需求，促进菌体生长，而且转速提高未对菌球造成可见的机械损伤，菌丝碎片少，菌球完整且较光滑。究其原因可能是高转速产生了大剪切力，切除了菌球边缘突出菌丝，限制了菌球的增大并使菌球缠绕致密[5]，进而利于菌球内部及菌球与发酵液之间的传质传氧，促进柠檬酸积累。在工业生产中发酵罐转速范围广，可以达到较高转速。因此，可以综合考虑成本等因素，通过将发酵罐的转速提高到合理范围来获得有利的菌球形态，从而促进柠檬酸合成。

3    結论与讨论

目前，我国柠檬酸年产量约200万t，占全世界总产量的60%以上，是世界第一的柠檬酸生产和出口国。近年来，随着柠檬酸在新型产业领域如金属清洁剂与无毒增塑剂等领域的开发应用，其全球市场需求量逐年增长（平均每年递增5%），从而导致提高柠檬酸生产效率成为一种迫切需求。柠檬酸的工业生产菌——黑曲霉作为一种典型的丝状真菌，影响其生产效率的因素有很多，菌丝体形态是其中最有效的参数之一，对发酵液的流变学性质及发酵过程中的氧气和营养物质的传输有重大影响。本研究对黑曲霉菌球形态和柠檬酸产量之间的相关性进行了探讨，发现在黑曲霉发酵生产柠檬酸的过程中，菌丝体形态对柠檬酸产率有非常重要的影响，其中菌球直径和致密度是至关重要的形态参数，将其控制在合适范围内可显著提高柠檬酸产量。当菌丝体离散生长时，发酵液黏度增加，限制了营养物质和氧气在发酵液中的传递，不利于菌体生长和柠檬酸的积累;如果形成的菌球直径较大且致密度过高，菌球内部不易与外部培养液交换营养和氧气，同样会降低柠檬酸产率。综上所述，本研究为柠檬酸工业生产中黑曲霉菌株的代谢改造[6]和过程调控提供了参考。

4    参考文献

[1] 王博彦，金其荣.发酵有机酸生产与应用手册[M].北京：中国轻工业出版社，2000.

[2] YANG J，JIAO R H，YAO L，et al.Control of fungal morphol-ogy for improved production of a novel antimicrobial alkaloid by marine-derived fungus Curvularia sp.IFB-Z10 under submerged fermentation[J].Process Biochem，2016，51（2）：185-194.

[3] WUCHERPFENNIG T，KIEP K A，DRIOUCH H，et al.Morp-hology and rheology in filamentous cultivations[J].Adv Appl Microbiol，2010，72：89-136.

[4] 孙小雯，郑之明，骆家玉，等.黑曲霉几丁质合成酶基因chs形态突变株的构建[J].食品工业科技，2016，18（37）：218-223.

[5] GIBBS P A，SEVIOUR R J，SCHMID.Growth of filamentous fungi in submerged culture：problems and possible solutions[J].Crit Rev Biotechnol，2000，20（1）：17-48.

[6] 杨晓涛，郭艳梅，曾祥峰，等.黑曲霉产柠檬酸的发酵过程表征及乙醛酸的形成[J].现代食品科技，2011，27（10）：1183-1186.