新疆某牧场牛病毒性腹泻的诊断及防控

王 标，吴妍妍，陈红莉，魏 勇，齐亚银*

(1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000；2.新疆天山军垦牧业有限责任公司，新疆 石河子 832000；3.新疆天澳牧业有限公司 新疆 奎屯 833200)

牛病毒性腹泻(BVD)又称牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD),是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的一种以发热、剧烈腹泻、黏膜糜烂溃疡、免疫抑制为主要特征的接触性传染病[1-2]。该病可引起仔畜先天性免疫缺陷、发育不良、存活率低等，还可引起妊娠母畜流产、产死胎、弱胎等繁殖障碍性疾病，对养牛业的健康发展带来严重的危害，同时造成严重的经济损失。目前该病呈世界性分布，广泛存在于美国、英国等国家，在我国新疆、内蒙、宁夏等20多个省市自治区均有该病的发生，随着养殖业的发展，该病时有发生，严重危害着养殖业的发展[3-5]。

2019年7月间，新疆某规模化牧场陆续出现犊牛腹泻、死亡的情况，发病犊牛在3月龄以内，并且发病急，病死率高。本试验以现场流行病学调查结合实验室诊断的方法，从发病原因、经过、临床症状、病理剖检变化入手，同时无菌采集发病犊牛的肠内容物、病死牛的脏器组织以及健康犊牛的肠内容物等样品，通过RT-PCR对BVDV 5’-UTR基因进行检测及序列分析，试验结果为本地区牛病毒性腹泻-粘膜病的诊断、免疫防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 在本次牧场犊牛发病期间无菌采集的4头病死犊牛肠组织、38份发病犊牛肠内容物、10份同群亚健康犊牛肠内容物。

1.1.2 主要仪器及试剂 移液器、电动组织研磨器购自上海力辰科技有限公司；TC-512 PCR 仪购自英国 Bibby 科技有限公司；DYY-6B 电泳仪购自雷琪实验器材有限公司；电子天平购自上海欢奥科技有限公司；离心机购自SiGMA 离心机公司；全自动凝胶成像系统仪购自美国BIO-RAD公司；总RNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；反转录试剂盒购自宝生物工程大连公司；引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 现场流行病学调查 2019年7月间，3次前往某大型牧场进行调查取样，与管理人员沟通，了解犊牛发病史、发病年龄、发病特点、往年发病率和发病季节，检查圈养犊牛情况，包括圈舍卫生、环境清洁程度、空气质量、温度、初乳投喂量、消毒、病犊隔离等情况，观察感染犊牛的症状，包括感染犊牛的整体状态、精神状态、体温、食欲和排便等情况，询问治疗情况和效果，并做好记录，解剖病死犊牛，观察内脏病理情况，采集样本。

1.2.2 RT-PCR检测 将采集的病料处理后，使用总RNA提取试剂盒提取病毒核酸，然后使用反转录试剂盒进行反转录，最后使用参照文献[4]中BVDV 5’-UTR引物(详表1)进行PCR和琼脂凝胶电泳试验以及目的条带的回收和测序，反转录反应体系及条件详见表2, PCR 反应体系及扩增程序详见表3。

表1 试验中BVDV 5’-UTR基因的引物序列

表2 反转录反应体系及条件

表3 PCR 反应体系及扩增程序

1.2.3 序列测定与分析 将从两头死亡犊牛肠组织中提取的核酸经RT-PCR扩增后的阳性产物切胶回收，然后与PMD19-T载体16 ℃连接过夜，使用E.coli DH5α感受态细胞对连接产物进行转化，再涂布于含有AMP的LB培养基中37 ℃培养12 h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，最后将这2份阳性样品送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。使用DNAStar软件分析测序结果，与GenBank中登录的8株BVDV-1型、4株BVDV-2型参考株(表4)进行序列比对和同源性比较，并使用MEGA软件构建BVDV5’-UTR基因系统进化树。

2 结果与分析

2.1 现场流行病学调查结果

本次疾病发生于炎热的夏季，发病犊牛年龄集中在3月龄以内，存在水平传播和垂直传播两种方式，潜伏期2～14 d不等。在调查期间该牧场共有

142头犊牛，发病率为39.43%(56/142)，死亡18头，病死率为32.14%(18/56)；犊牛圈舍整体环境较差，粪便未能及时清理，未安装换气扇，导致空气不流通，氨气味较重，没有降温设备，圈舍整体温度较高。饲养管理人员防范意识淡薄，仅使用石灰对地面进行消毒，未对周围环境进行消毒，发病犊牛仍与其他健康犊牛同群饲喂，未进行严格隔离。查阅资料表明，该牧场往年同季节也曾发生过本病。

发病犊牛主要表现为精神沉郁、食欲减退或废绝、反刍停止、被毛粗乱无光泽、体温升高至39.8～41.5 ℃之间、严重腹泻、部分粪便中带有血液和肠黏膜碎片、部分病牛表现有神经症状和呼吸困难。病理解剖可见病死牛严重脱水、肠道有大量出血点、肠黏膜有出血点、肠壁菲薄、胃肠道内容物有大量气泡、肠系膜淋巴结肿大、心脏表面充血、少量出血点、心包内有大量积液，打开颅腔可见脑组织肿胀有出血点、颅腔内有积液,详见图1。

注:1.血样粪便；2.肠道广泛性出血；3.肠黏膜出血；4.胃肠内容物有大量气泡；5.肠系膜淋巴结肿大出血；6.心脏表面充血出血

2.2 RT-PCR检测结果

将采集的病料样品经过RT-PCR检测，可以扩增得到293 bp大小的目的基因，确定该病病原为BVDV，其中死亡犊牛肠组织核酸提取样阳性率为100.00%(4/4)，发病犊牛肠内容物提取样核酸阳性率为94.74%(36/38)，同群亚健康犊牛肠内容物提取样核酸阳性率为30.00%(3/10)，结果详见图2。

注:M为DNA 标准 DL 1000; 0为阳性对照1～2为死亡犊牛组织提取样;3～5为发病犊牛粪便提取样;6为亚健康犊牛粪便提取样;7为阴性对照。

2.3 遗传进化分析

此次共送检测序两份RT-PCR阳性样品，将这两份阳性样品的测序结果使用DNAStar Meggalign软件与部分BVDV参考株进行序列对比(图3)。此次测序的2份阳性样品的同源性为99.0%，XJB19-01株、XJB19-02株均与参考BJ-2013的同源性最高，分别为97.9%、98.4%，属于BVDV-1a型。使用MEGA软件将测序的两株BVDV基因与部分参考株做系统遗传进化树，结果(图4)表明，相比于其他参考株，XJB19-01和XJB19-02与参考株BJ-2013处于同一进化分支，三者亲缘关系最近。

图3 检测阳性基因与GeneBank上参考株同源性比较

图4 BVDV 5’-UTR 基因系统进化树

3 讨论

近年来，随着我国养殖业的快速发展，越来越多的疾病也随之而来，严重困扰并影响着养殖业的健康发展。牛病毒性腹泻-粘膜病目前在世界各地均有发病的报道，该病自20世纪40年代在美国首次发现以来[6]，便在世界范围内广泛流行和传播。目前为止在我国新疆等20多个省市自治区都有发病，表明该病具有很强的传染性，同时牛群感染BVDV已经是很普遍的现象[7-8]。

本次试验采用现场流行病学调查和实验室检测相结合的方法进行诊断，具有较高的准确性。通过对发病犊牛的年龄、临床症状、病理剖检情况及实验室检测发现，该牧场发病感染牛群呈现低龄化，引起的病变典型，病死率高，存在较多的隐性感染牛，增大了防控难度。

加强饲养管理，隔离淘汰病牛，严格按照消毒程序对圈舍进行彻底消毒，改善饲养环境，降低炎热的天气对犊牛造成的应激反应，提高犊牛的舒适感。健康牛群使用BVD-IBR二联疫苗(哞乐优)免疫。在免疫前14 d、免疫后21 d采用ELISA的方法对随机选取的21头健康犊牛的血清进行BVDV抗体检测，阳性率分别为61.90%(13/21)、90.48%(19/21)，免疫后抗体水平相比于免疫前得到了显著的提升，经上述方法的综合防控，该牧场已经有效的控制了本病的进一步发生。由此也进一步表明牛群整体抗体阳性率达到较高水平时可以避免疾病在牛群内传播，同时疫苗免疫也是防控疾非常有效的方法之一。

关于本病的防控，全世界养牛国家主要有两种做法，一是欧洲各国目前采取的是检疫、淘汰的方法，取得了较好的效果，但也存在投资大、耗时长等问题；二是美国等部分地区的做法，采用检疫结合免疫的方式，效果较好[9-10]。结合我国畜牧业国情及本次试验结果，建议首先对牛群进行检疫，筛选并淘汰PI牛，从根本上消灭传染源；其次制定严格全面生物安全防控，加强消毒，加强饲养管理，改善牛群生长环境，减少应激，提高牛群抗病力；同时采用BVD-IBR二联疫苗全群免疫，科学规范免疫程序，定期抗体检测，通过科学的免疫防控控制该病的发生。