牛源荚膜血清A1型溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

汪 阳，薛 晶，赵洁雅，汪 萍，沈辰峰，苗书魁，梁纪元，马文戈，张 杨，夏 俊*，杜 玮*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆畜牧科学院，新疆 乌鲁木齐 830000)

溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)原名溶血性巴氏杆菌(Pasteurellahaemolytica)，栖息在鼻咽部与宿主保持一种共生的关系[1-2]，是引起运输热(shipping fever)即牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)的病原之一，具有全球分布性[3]。溶血性曼氏杆菌是一种机会致病菌，当宿主因运输、环境等应激或感染呼吸道病毒或支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)导致抵抗力下降时，该菌会通过呼吸道浆液性和黏液性分泌物从共生状态被释放出[4]，从而侵袭宿主肺部引起呼吸道疾病[2,5]。近年来由溶血曼氏杆菌引起牛、羊急性肺炎及败血症不断增多，给牛、羊养殖业带来较大危害。2019年10月，新疆某规模化牛场陆续发生了由于长途运输导致牛运输综合征的疑似病例，此批牛在运输途中及到场后发病死亡，病牛体温升高至41～41.5 ℃、咳嗽、呼吸困难、流鼻涕，病程短、死亡快(1～5 d)，先后死亡10余头。剖检急性死亡牛可见心外膜、心冠脂肪出血，肺脏严重充血、出血，纤维素性肺炎，肝脏、胆囊肿大，但脾脏不肿大。为了确定引起该病的病原，本研究无菌采集了病死牛心脏、肺脏等病变组织进行细菌的分离鉴定，并对分离菌的生物学特性进行分析，为进一步探讨溶血曼氏杆菌的致病机制提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 心血及肺脏组织，采自新疆某牛场新购进的病死牛。

1.1.2 主要试剂 脑心浸液肉汤(BHI)购自北京奥博星生物技术有限公司；革兰氏染色液购自北京索莱宝科技有限公司；细菌微量生化反应管购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.1.3 试验动物 18～22 g健康巴贝斯小鼠购自新疆维吾尔自治区疫病预防与控制中心动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 取心血及肺脏病变组织在无菌环境下接种于BHI液体培养基上，置于37 ℃水平摇床(150 r/min)进行增菌培养，并将肺脏病变组织于无菌条件下切取一小块涂抹于BHI固体培养基上，37 ℃培养24 h。24 h后将菌液进行革兰氏染色镜检，然后将固体平板上的单菌落挑出再接种于BHI液体培养基上，置于37 ℃水平摇床(150 r/min)进行培养并观察细菌的生长状况，分离株命名为XJMA1-1。

1.2.2 生化鉴定试验 无菌操作台内将生化鉴定管上端用砂轮划痕折断，与酒精灯火焰消毒，然后用接种环将纯化的细菌培养物接种于 D-葡萄糖、D-麦芽糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-乳糖、D-木糖、靛基质、脲酶、吲哚等微型生化鉴定管，置灭菌平皿内或小试管架上，放于37 ℃培养箱内，按规定时间观察记录结果。

1.2.3 PCR鉴定 所用引物为溶血性曼氏杆菌鉴定引物，以及溶血性曼氏杆菌血清型A1型引物、A2型引物、A6型引物进行PCR鉴定，PCR反应体系50 μL进行PCR扩增：

其中2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物各2 μL，模板2 μL，超纯水补至50 μL[6]，离心混合均匀后置PCR扩增仪中。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃循环变性30 s，56 ℃退火复性30 s，72 ℃延伸40 s，进行30个循环；72 ℃终延伸10 min，最后4 ℃保存。反应结束后，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，参照标准DNA 2000 Marker，对待检样品目的DNA片段进行鉴定。用琼脂凝胶回收试剂盒将PCR产物回收后，送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.4 毒力因子检测 对分离株进行16SRNA、core、9s6、lkt、lk、p1p、Hy、dna、T、fbp、tbp等毒力基因检测，PCR反应体系及方法同1.2.3。

1.2.5 致病性试验 选取健康的巴贝斯小鼠，试验前7 d，观察小鼠食欲、精神状况，确保小鼠食欲、精神正常的情况下将分离株分别腹腔注射200 μL 4只小鼠，另外4只小鼠作为空白对照，并随时观察小鼠的食欲和精神状况。

1.2.6 药敏试验 按常规纸片法进行药敏试验，37 ℃培养24 h后观察结果

2 结果与分析

2.1 细菌形态及培养特性

在病料及培养物涂片后，革兰氏镜检可见球状或杆状、两端钝圆，呈单个、成对散在排列的革兰氏阴性球杆菌(图1)。从心血、肺脏分离的菌株在BHI固体培养基上生长良好，菌落呈圆形、光滑、湿润、灰白色的小菌落(图2)。

图1 革兰氏染色镜检

图2 BHI固体培养基

2.2 生化鉴定试验结果

生化试验结果(表1)显示，分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、木糖等碳水化合物，不发酵脲酶和吲哚，产生少量酸而不产气，符合溶血曼氏杆菌生化特性。

表1 生化鉴定试验结果

2.3 PCR鉴定结果及分析

用曼氏杆菌鉴定引物，以及曼氏杆菌血清型A1型引物、A2型引物、A6型引物进行PCR扩增，结果显示，4株菌均为曼氏杆菌A1型(图3)。

图3 PCR扩增结果图

2.4 毒力因子检测结果及分析

用16SRNA、core、9s6、lkt、lk、p1p、Hy、dna、T、fbp、tbp基因引物进行PCR扩增结果显示，该菌株在16SRNA、9s6、lkt、lk、Hy、dna、fbp基因扩增出600、170、440、180、440、170、160的条带(图4)，与预期片段相符。

图4 溶血性曼氏杆菌毒力基因检测

2.5 致病性实验结果

攻毒后小鼠连续观察4 h后，出现精神沉郁，被毛粗乱，18 h后小鼠陆续死亡(图5)。

图5 溶血性曼氏杆菌小鼠攻毒试验

2.6 药敏实验结果

药敏实验结果表明，溶血性曼氏杆菌分离株对左氧氟沙星、氟本尼考、替米考星高度敏感，对头孢曲松钠、阿奇霉素、乳酸环丙沙星中度敏感，对硫酸阿米卡星、盐酸林可霉素、克林霉素、硫酸庆大霉素不敏感。

3 讨论

溶血性曼氏杆菌是引起牛运输热的主要病原之一[7-8]。近年来，随着新疆养牛业的发展，各地频繁调运牛，由运输应激引发病原感染造成调运牛死亡病例日趋增多，给牛的调运带来较大的经济损失[9-10]。但由溶血性曼氏杆菌引发调运牛发病死亡的确诊报道及对病原的生物学特性分析在新疆鲜有报道。本试验从发生急性败血症死亡牛的病变组织中分离到革兰氏阴性短杆菌，病料涂片瑞氏染色可见两极浓染及明显的荚膜，细菌在脑心浸液肉汤(BHI)固体培养基上生长良好，菌落呈圆形、光滑、湿润、灰白色小菌落。生化试验结果显示，分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖和木糖等碳水化合物，不发酵脲酶和吲哚，与冯旭飞等[11]报道基本一致，符合溶血性曼氏杆菌的生化反应特性。通过PCR鉴定试验发现，分离菌与溶血性曼氏杆菌的同源性高达99%，表明分离株均为溶血性曼氏杆菌。溶血性曼氏杆菌共有12个血清型，其中A1和A2血清型是优势菌株，A1血清型是牛运输热的主要病原，A2血清型是引起绵羊发病的最常见的血清型，也有报道认为其他血清型的菌株也与疾病的发生有关。通过血清型基因序列比对发现，分离菌与A1型溶血曼氏杆菌的同源性高达98%以上，表明分离株为A1型溶血曼氏杆菌。国内对血清型鉴定菌株的研究极少。因此有必要进一步研究该分离株的致病性，为牛、羊感染溶血性曼氏杆菌的控制提供依据。

4 结论

本试验对引起牛运输热的病原进行分离鉴定，经细菌形态学观察发现该菌为两端钝圆，呈单个或成对散在排列的革兰氏阴性球杆菌；生化鉴定结果显示该菌不发酵脲酶和吲哚，产生少量酸而不产气，符合曼氏杆菌的生化特性。经形态观察、培养特性和生化鉴定、PCR鉴定及PCR分型鉴定确定该分离菌株为A1型溶血性曼氏杆菌。使用药敏纸片，将该分离菌株进行药敏实验，发现其对左氧氟沙星、氟本尼考、替米考星高度敏感，对头孢曲松钠、阿奇霉素、乳酸环丙沙星中度敏感，对硫酸阿米卡星、盐酸林可霉素、克林霉素、硫酸庆大霉素不敏感。小鼠致病性实验结果证明该菌株对健康小鼠有一定的致病能力。