鹅圆环病毒JX1 株ORF3 基因序列分析

万春和 黄 瑜

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省禽病防治重点实验室/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心 福州 350013；2.龙岩学院/预防兽医学与生物技术福建省高校重点实验室 福建龙岩 364012）

根据国际病毒分类委员会 （International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV） 最 新 分 类（https://talk.ictvonline.org/taxonomy/）， 鹅 圆 环 病 毒（Goose circovirus，GoCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）成员。

GoCV 病毒颗粒为无囊膜、二十面体对称、单股负链环状闭合DNA 病毒， 直径约15 nm。 GoCV 于1999 年由Soike 等从生长发育不良、 体重下降的患鹅中发现[1]。 随后 ，GoCV 在我国台湾[2]、浙江[3]、江西[4]、广东[5]、山东[6]、福建[7]、重庆[8]、广西[9]等多地鹅群中发现。 GoCV 基因组全长为1 821 nt 左右，其5'-端具有典型的颈环结构， 其顶部有1 个保守的9 碱基序列“TATTATT①AC”（①position 1）；其 3'-端基因间区存在正向或反向的重复序列。 与其他圆环病毒属成员基因组结构类似，GoCV 还编码有两个大的开放阅读框（ORF），位于病毒左侧与病毒复制相关的非结构蛋白（Rep）和位于右侧抗原相关的结构蛋白（Cap）[1-4]。

近年来，在鸭圆环病毒（Duck circovirus，DuCV）基因组中除ORF-V1 和ORF-C1 两个主要ORF 之外，新鉴定的位于ORF-V1 互补链上的第三个功能性ORF，命名为 ORF3[10]。 对 DuCV 的 ORF3 基因分析发现，ORF3 基因在鸭圆环病毒两大基因型（DuCV-G1 和 DuCV-G2） 存 在 特 征 性 差 异 ，即DuCV-G1 的 ORF3 基因大小均为 237 bp， 编码78 个氨基酸； 而DuCV-G2 的 ORF3 基因大小均为297 bp，编码98 个氨基酸；同型之间氨基酸的同源性为 89.9%～100%， 而两型之间氨基酸的同源性只有72.2%～81.0%。进一步对DuCV-G1 和DuCV-G2 ORF3 基因分析比对发现， 由于DuCV-G1 的ORF3基因发生T236A 突变（由TTG 突变为TAG，产生新的终止子（Premature stop condon）导致翻译提前终止， 使 DuCV-G1 比 DuCV-G2 的 ORF3 基因 3'-末端缩短 60 个核苷酸（即 20 个氨基酸）[11]。

目前，尚未见GoCV ORF3 基因的研究报告，本研究通过分析本团队前期鉴定的GoCV JX1 株（GenBank 登录号：GU320569）[4]基因组 ORF3 基因特征， 为后续开展GoCV ORF3 基因功能研究提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 毒株 朗德鹅源 GoCV（JX1 株，GenBank 登录号：GU320569）[4]由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定并保存。

1.2 JX1 株ORF3 基因基本理化特性分析 经序列分析，JX1 株ORF3 基因位于ORF-V1 互补链上127 至 426 位，其基因全长为 300 bp，编码 99 个氨基酸，分子量为11 583.22 Da，理论等电点（Theoretical pI） 为 8.84； 总原子数为 1 619， 其组成为C515H802N154O144S4，带负电荷氨基酸（Asp+Glu）为 8 个，带正电荷氨基酸（Arg+Lys）为 10 个；不稳定指数为80.95，是一个不稳定蛋白；脂肪系数89.70，总平均疏水性指数为-0.472。

1.3 GoCV 序列分析

1.3.1 全基因组遗传进化分析 由于DuCV 不同基因型ORF3 基因存在特征性差异， 为探讨 GoCV ORF3 基因是否存在类型现象， 本研究先对Gen-Bank 中登录的 GoCV 全基因组序列 （共 67 株GoCV）进行遗传分析。 利用 MEGA6.0 软件[12]绘制GoCV 全基因组遗传进化树， 绘制遗传进化树采用NJ 法 （Neighbor-Joining Methods）， 重 复 计 算1 000 次（Bootstrap=1 000）。

1.3.2 ORF3 基因遗传进化分析 将上述 67 株GoCV 的 ORF3 基因利用 MEGA6.0 软件绘制 ORF3基因遗传进化树， 绘制遗传进化树采用 NJ 法（Neighbor-Joining Methods）， 重 复 计 算 1 000 次（Bootstrap=1 000）。

1.3.3 ORF3 基因核苷酸同源性比较 利用Lasergene MegAlign 软件（By Clustal W Method），将 JX1株与其他66 株GoCV 的ORF3 基因进行核苷酸同源性分析， 比较JX1 株与其他ORF3 基因不同遗传进化分支毒株的核苷酸同源性。

2 结 果

2.1 全基因组遗传进化分析 从GoCV 全基因组遗传进化分析可见 （见图1）， 可分为5 个基因型（Genotype 1 至 Genotype 5）。 其 中 Genotype 3 型（7 株）、Genotype 4 型（1 株）和 Genotype 5 型（2 株）均为欧洲波兰分离株， 其余57 株均处于经典的Genotype 1 型和Genotype 2 型。需要指出的是，波兰地区的GoCV 全基因组遗传进化均为复杂[13]，Genotype 2a1 亚型和Genotype 2a2 亚型也有分布， 且欧洲其他地区流行的GoCV 也均处于Genotype 2 型内的Genotype 2a1 亚型和Genotype 2a2 亚型。

2.2 ORF3 基因组遗传进化分析 从ORF3 基因组遗传进化分析可见（见图2），同样可分为5 个遗传进化分支（Clade 1 至Clade 5），但其与全基因组基因分型存在很大不同，Clade 1 分支GoCV 均为中国株，其中中国台湾省GoCV 均处于Clade 1a 亚分支，中国其他地区GoCV 则分别处于Clade 1b 亚分支、Clade 1c 亚分支和 Clade 1d 亚分支； 欧洲地区GoCV 则分处于 Clade 2 分支、Clade 3 分支、Clade 4分支和Clade 5 分支。

2.3 ORF3 基因分析 对所有 67 株 GoCV 的ORF3 基因进行分析发现， 其中 60 株 GoCV 的ORF3 基因长度与 JX1 株一致， 均为 300 bp。 但是6 株 GoCV （G1 株、G4 株、G9 株、G15 株、G16 株、GoCV-Hun2 株）的 ORF3 基因长度为 309 bp；需要指出的是， 该6 株GoCV 在ORF3 基因进化上均处于Clade 2 分支， 但处于Clade 2 分支的其他GoCV的ORF3 基因长度均为300 bp， 关于该差异的生物学意义还需要作更进一步深入研究。

2.4 ORF3 基因核苷酸同源性比较 从核苷酸同源性分析比较结果可见，JX1 株与 yk1 株（AY633653）、yk3 株（DQ192280）的核苷酸同源性最高，均为100%；与DG1 株的核苷酸同源性最低，仅为89.0%。

3 讨 论

图1 GoCV 全基因组遗传进化分析

图2 ORF3 基因组遗传进化分析

目前， 对于圆环病毒科圆环病毒属猪圆环病毒1 型和 2 型（PCV1 和 PCV2）的 ORF3 基因功能研究较多，且研究发现，PCV1 和 PCV2 与 DuCV 类似，其中PCV1 （对猪群不致病） 的ORF3 基因大小均为237 bp， 编码 78 个氨基酸；PCV2 （对猪群致病）的ORF3 基因大小均为 315 bp， 编码 104 个氨基酸[14]。Liu 等通过构建ORF3 缺失突变体病毒与野生型病毒比较发现，ORF3 缺失突变株不影响PCV2 复制，但参与了外源性细胞凋亡。 通过测定caspase 3、caspase 8 和 caspase 9 基因表达发现，PCV2 诱导的细胞凋亡需要激活caspase 8 （而不是caspase 9），caspase 8 的激活导致caspase 3 的激活，使感染细胞中caspase 底物的裂解。 研究还发现，PCV2 的ORF3与 P53 竞争结合 pPirh2，通过干扰 pPirh2 对 P53 泛素化， 从而诱发了P53 介导的凋亡通路。 PCV2 的ORF3 蛋白通过与胞浆中G 蛋白信号调节因子（RGS16）相互作用，导致RGS16 发生泛素介导的蛋白酶降解，从而促进NF-kB 通过ERK1/2 信号通路移位胞核内，增强IL-6 和IL-8 的转录，因而在细胞周边诱发严重的炎性反应和白细胞浸润， 这可能也与PCV2 致病性相关[15-16]。研究还发现，过表达PCV2的ORF3 蛋白可诱导猪外周血淋巴细胞（PBMCs）凋亡[17]。 但有意思的是，对 PCV1 的 ORF3 蛋白诱导的细胞凋亡研究结果表明，PCV1 的 ORF3 蛋白比PCV2 的ORF3 蛋白可诱导更多细胞发生凋亡[18]。

对于 DuCV 的 ORF3 基因功能研究发现，DuCV-G1 的 ORF3 比 DuCV-G2 的 ORF3 对 禽 源DF-1 细胞表现出更高的凋亡能力； 且缺失DuCVG2 的 ORF3 末端20 个氨基酸后的 ORF3 （长度与DuCV-G1 的ORF3 一致）表现出更高的促宿主细胞凋亡能力[19-20]。 但是， 通过对 67 株 DuCV-G1 的ORF3 基因分析发现，不同遗传进化分支的ORF3 基因长度却与 DuCV 两个基因型 （DuCV-G1 和DuCV-G2）、PCV 两个基因型（PCV1 和 PCV2）存在特征性差异及核定位信号差异明显不同， 虽然有6株GoCV 的 ORF3 基因为 309 bp，但是与其他 61 株GoCV 的ORF3 基因编码区氨基酸序列一样，均不存在典型的核定位信号[21]。

研究还发现，GoCV 全基因组与ORF3 基因的遗传进化分析结果存在明显不同， 虽然绝大部分GoCV 从全基因组遗传进化分析也可以同样分为两个大的基因型， 但是却与ORF3 基因的遗传进化分析结果存在明显不同， 尤其是ORF3 基因的遗传进化表现为明显的地域性，但并不表现出时间性；上述结果表明，ORF3 基因的进化频率并不完全与GoCV全基因组一致， 具体机制还需要作更进一步的深入研究。