猪脾转移因子注射液异常毒性检查研究

徐 磊 游开铿 郑 青 林祚贵 郜飞燕 胡小榕 傅光华 施少华 刘小龙 许秀梅 杜 君 廖惠珍 黄 瑜＊ 张渊魁＊

（1.福建农业职业技术学院 福州 350119；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013；3.派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500；4.兆丰华生物科技（南京）有限公司 南京 211102；5.福州市长乐区农业农村局 福建长乐 350200）

转移因子（Transfer Factor，TF）是动物白细胞中具有免疫活性的T 淋巴细胞所释放的一类能够转移致敏信息的可透析小分子量物质。 作为多肽类物质，TF 的肽分子量相比蛋白质小很多， 但具有较高的生物学活性，具有无毒副作用、无药物残留、无抗原性、分子质量小、不产生对抗抗体、不引起过敏反应、使用安全、作用迅速、效果显著、来源广、无种属特异性和可超越种系界限应用的优点， 具有十分重要的研究价值和应用价值[1-6]。 在人类医学中，TF 不仅已成为当前无法治疗的疾病的标准疗法， 而且已成为现有疗法具有毒副作用的疾病的标准疗法。 此外，TF 还作为与抗菌药或抗病毒药联合使用的辅助药物， 已被广泛用于无确切疗法的细菌病和病毒病的治疗[7-8]。 1979 年TF 被引入到兽医免疫和临床治疗中，可以提高猪、鸡、羊等多种动物的细胞免疫水平和体液免疫水平[9-14]。

有别于药品本身具有的毒性特征， 异常毒性是指由生产制造过程中引入或其它原因所致的毒性。异常毒性检查法，不仅可用于检查药品在生产制造、制剂过程中引入的外来异物， 而且可用于检查药物降解产生的不正常毒性反应， 适用于对多组分多成分制品中有毒杂质和有毒成分的检测[15-16]。

本研究旨在建立TF 的异常毒性检查方法，并对本发明专利TF 制造技术进行工艺验证， 按照本课题组已授权国家发明专利TF 制造技术制备3 批TF[17-20]，通过小鼠动物模型建立异常毒性检查方法，并对3 批TF 开展异常毒性检查， 以期明确本发明专利TF 制造技术对异常毒性的控制效果， 为规模化制造兽用TF 提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物 体重17～20 g 健康昆明小鼠，由福建医科大学实验动物中心提供。

1.2 TF 制备 按照本课题组已授权的国家发明专利制备3 批TF[17-20]：以健康猪脾脏为原料，经匀浆、细胞破碎、灭活、微滤、超滤、除菌后精制而成，3 批TF 分别为 TF-1、TF-2、TF-3。 经检验， 所制备 3 批TF 的多肽含量分别为 2.92 mg/mL、2.68 mg/mL 和2.60 mg/mL， 脱 E 受体法效力分别为 15.7%、15.4%和 17.1%，核糖含量分别为 59.8 μg/mL、58.4 μg/mL和 56.3 μg/mL， 细菌内毒素含量均不超过10 EU/mL，pH 值 分 别 为 6.88、6.92 和 6.96， 在253 nm 处均有最大吸收峰，OD260nm/OD280nm的比值分别为 2.29、2.30 和 2.32（均大于 1.9），无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、安全检验、过敏反应检查、蛋白质定性检验、热原检查均合格。

1.3 试剂 磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、生理盐水均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.4 仪器 光学显微镜为Nikon 公司产品， 型号：ECLIPSE E100； 紫外分光光度计为日本岛津产品，型号：UVmini-1240；离心机为湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品，型号：TDZ5-WS；电子天平为上海精科天美科学仪器有限公司产品， 型号：JA2603B； 水浴锅为上海上登实验设备有限公司产品，型号：HH-S2。

1.5 试验设计 按照现行《中国兽药典》附录“异常毒性检查法”对3 批TF 进行异常毒性检查，具体如下：取小鼠 15 只，随机分成 3 组：第 1 组、第 2 组和第 3 组，每组 5 只，分别编号 1～15。 3 批 TF 各随机抽取 3 瓶，TF-1、TF-2 和 TF-3 分别对应混匀后作为待检样品。第1、2 及3 组小鼠分别以0.5 mL/只剂量腹腔注射待检样品，进行异常毒性检查，试验设计见表1。

表1 异常毒性检查试验设计

1.6 结果判定 48 h 内小鼠应全部健活；如果小鼠有死亡， 应选取加倍数量小鼠开展重检，48 h 内重检小鼠应全部健活。

2 结 果

结果显示，3 组小鼠于腹腔注射后48 h 内均健活，15 只小鼠全部没有出现异常情况，见表2。因此，判定3 批TF 无异常毒性，3 批TF 的异常毒性检查结果均符合现行《中国兽药典》规定。

表2 试验结果

3 结 论

目前， 我国的兽用药品检验是按照 《中国兽药典》2015 年版的标准来执行的。 在兽药典中安全性检查包括有无菌、微生物限度、热原、细菌内毒素、异常毒性、过敏等检查项目。 异常毒性、过敏检查是生物类药物所特有。 其中， 异常毒性检查法是用于检查药物的生产工艺水平， 而不是检查药物本身毒性[21]。

常规 TF 制备技术利用透析法回收 TF，即Lawrence 方法。 该法工艺简单易于实现、操作简单、设施设备投入少。 但是，Lawrence 方法依靠透析袋内外浓度差完成透过分离，属于无动力分离，不仅具有透过效率差、 分离收率低、 物料浪费大等工艺劣势，而且Lawrence 方法工艺时间长、制备周期长、容易细菌繁殖导致所获得TF 容易腐败、 内毒素含量高。 此外，Lawrence 方法制备 TF，机械化程度低，主要依靠人员手工操作将透析原液转移至透析袋内进行透析，在人工装袋过程中，透析原液中的外源细菌和外源病毒极易污染透析袋外壁， 并且所用透析袋的完整性无法验证，容易出现不易察觉的轻微损伤，这些均导致TF 异常毒性检验容易出现不合格。 因此， 生产稳定性差，Lawrence 方法不适合规模化生产。

本课题组已授权的国家发明专利TF 制备技术，采用切向流过滤方法制备TF[17-20]。 有别于Lawrence方法及其他常规垂直过滤方法， 切向流过滤方法采用液体流动方向与过滤方向垂直的工艺流程，即：液体流动方向与过滤膜平面平行， 部分液体在侧向跨膜压力的作用下垂直穿过膜孔，实现组分分离。切向流过滤方法会产生二次流，即湍流。在二次流的作用下，流动液体会在过滤介质表面产生剪切力，使过滤介质表面的沉淀从膜表面剥离，减少了凝胶层（滤饼层）在膜表面的堆积，降低了过滤介质表面堵塞和污染的机率，保证了稳定的过滤速度[22]。

本试验按照现行《中国兽药典》附录中“异常毒性检查法”，对本课题组已授权国家发明专利TF 制备技术所制备的3 批猪脾转移因子注射液开展异常毒性检查。 结果显示，3 批猪脾转移因子注射液腹腔注射后48 h 内全部小鼠均健活，符合现行《中国兽药典》规定。 结果表明，本发明专利制备的猪脾转移因子注射液无异常毒性， 制造工艺异常毒性的控制效果良好，保证TF 制品的安全性。