微波辅助酶萃取-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定灵芝中6种硒形态

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(1.乌兰察布医学高等专科学校,乌兰察布 012000; 2.乌兰察布市兽药监察所,乌兰察布 012000)

硒是人体必须的生命元素[1],是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性中心,具有清除自由基、抗癌防癌、保护肝脏、防衰老、增强免疫等作用[1-2]。自然界中硒主要以无机硒和有机硒两种形态存在,有机硒易被吸收,生物学活性高,对人体有益[3-4];而无机硒对人体有害,其中硒酸盐及亚硒酸盐毒性较大,会导致生物体病变,日本已于1993年禁止在食品和饲料中添加无机硒[5-6]。一些商贩为了提高商品中硒含量,会在其中非法添加硒酸盐、亚硒酸盐等无机硒。为保障消费者权益,指导消费者合理补硒,需对市售富硒产品中硒形态进行检测。

目前关于硒形态分析方法主要有原子荧光光谱法(AFS)[7-8]、原子吸收光谱法(AAS)[9]、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)[10]、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[11-12]和高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)[13-15]等。其中HPLC-ICP-MS将高选择性的色谱分离技术与高灵敏度的质谱检测技术联用,与现有其他技术相比,其在准确度、灵敏度、分析效率等方面均有很大优势[15-16]。

本工作以灵芝为研究对象,采用微波辅助酶萃取灵芝中硒酸[Se(Ⅵ)]、亚硒酸[Se(Ⅳ)]、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒代乙硫氨酸(SeEt)、甲基硒代半胱氨酸(Se MeCys),建立了HPLC-ICP-MS同时测定灵芝中6种常见硒形态的方法,以期为灵芝等中草药中硒形态的分离和检测提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪;Agilent 7700x型电感耦合等离子体质谱仪;MARS型微波消解仪;AVANTI J-15型高速冷冻离心机;Milli-4.6 mm,5μm)等分析柱时对硒形态分离效果的影响。结果表明:Hamilton PRP-X100阴离子色谱柱(250 mm×4.1 mm,10μm)能有效分离Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet、SeCys2、SeMeCys等5种硒形态;安捷伦ZORBAX SB-Aq C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱可有效分离6种硒形态;其余4种色谱柱存在部分目标物不出峰、重叠[Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)]或分离度差等现象。因此,试验选择安捷伦ZORBAX SB-Aq C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱进行分析。plus 2150型超纯水处理系统;ME 204E型电子分析天平。

6种硒形态标准储备溶液:1 000 mg·L-1,分别称取适量硒形态标准品,用5%(体积分数,下同)盐酸溶液溶解并定容至100.0mL。

6种硒形态混合标准溶液:10 mg·L-1,分别吸取6种硒形态标准储备溶液1mL于100mL容量瓶中,用5%盐酸溶液稀释至刻度。

6种硒形态混合标准溶液系列:分别吸取适量6种硒形态混合标准溶液于100mL容量瓶中,用5%盐酸溶液稀释至刻度,混匀,配制成质量浓度分别为0.5,1.0,5.0,10.0,25.0,50.0,100.0μg·L-1的混合标准溶液系列。

Se(Ⅵ)[GBW 10033,(75.1±2.4)μg·g-1]、Se(Ⅳ)[GBW 10032,(68.9±1.4)μg·g-1]、SeMeCys[GBW 10088,(34.8±1.0)μg·g-1]、SeCys2[GBW 10087,(44.2±1.0)μg·g-1]、Se Met[GBW 10034,(97.9±2.5)μg·g-1]等硒形态标准品的纯度不小于95%;SeEt标准品的纯度为98%;蛋白酶XIV的酶活性为200 000 U·g-1;其他所用试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 微波

1)萃取 功率300 W;升温程序:0～10 min,由室温升至37 ℃,保持30 min。

2)消解 功率1 200 W;升温程序:0～10 min,由室温升至160 ℃,保持30 min。

1.2.2 HPLC

安捷伦ZORBAX SB-Aq C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温35 ℃;流动相为含5 mmol·L-1庚烷磺酸钠的20 mmol·L-1柠檬酸溶液(pH 4.5);等度洗脱;流量为1.0mL·min-1。

1.2.3 ICP-MS

高频入射功率1 500 W;蠕动泵转速0.1 r·min-1;雾化室温度2 ℃;载气流量0.8 L·min-1,等离子体气流量15 L·min-1,辅助气流量0.8 L·min-1;采样锥孔径1.0 mm,截取锥孔径0.7 mm;检测同位素82Se;采样周期0.8 s,采集时间600 s。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

用粉碎仪将灵芝磨成粉状后,过0.15 mm筛,于4 ℃避光保存备用。

1.3.2 6种硒形态的测定

称取0.5 g灵芝样品于50mL离心管中,加入水10mL和蛋白酶XIV 20 mg按微波萃取条件进行萃取,萃取液经10 000 r·min-1转速离心10 min后,过0.22μm滤膜,滤液供HPLC-ICP-MS分析。

1.3.3 ICP-MS总硒的测定

称取0.2 g灵芝样品于消解罐中,加入3mL市售过氧化氢溶液和5mL硝酸按微波消解条件进行消解,消解结束后冷却,将消解液转移至25mL容量瓶中,用5%盐酸溶液稀释至刻度,混匀,按照ICP-MS仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

结合硒形态分析的相关文献[15-17],试验考察了分别采用Hamilton PRP-X100阴离子色谱柱(250 mm×4.1 mm,10μm)、Waters Symmetry Shield RP18(250 mm×4.6 mm,5μm)、安捷伦XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、AichromBond-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、资生堂Shiseido C18(250 mm×4.6 mm,5μm)、安捷伦ZORBAX SB-Aq C18色谱柱(250 mm×

2.2 色谱流动相的选择

结合待测6种硒形态的理化性质,试验考察了分别以磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、柠檬酸等化合物溶解而成的弱酸性溶液为流动相,并在其中添加庚基磺酸钠、七氟丁酸、氢氧化四甲基胺等离子对试剂时对6种硒形态的分离情况的影响。结果表明:以含0.1%(体积分数)七氟丁酸的磷酸二氢铵或磷酸二氢钾溶液作为流动相时,4种有机硒分离效果较好,而Se(Ⅵ)和Se(Ⅳ)色谱峰重复性较差,且易与SeCys2色谱峰重叠;以含5 mmol·L-1庚烷磺酸钠的20 mmol·L-1柠檬酸溶液(pH 4.5)为流动相进行等度洗脱时,Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、Se Met、SeCys2、SeEt、Se MeCys等6种硒形态可完全分离,且峰形尖锐对称。因此,试验选择含5 mmol·L-1庚烷磺酸钠的20 mmol·L-1柠檬酸溶液(pH 4.5)作为流动相,并在优化条件下对50μg·L-1的6种硒形态混合标准溶液进行测定,色谱图见图1。

图1 6种硒形态的色谱图Fig.1 Chromatogram of the 6 selenium species

由图1可知:Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、Se Met、SeCys2、SeEt、Se MeCys等6种硒形态的保留时间分别为3.21,4.06,6.41,4.38,7.38,6.05 min。

2.3 检测同位素的选择

基于硒在自然界中有80Se、78Se、76Se、82Se、77Se、74Se等6种同位素(其中80Se的丰度最大,其次为78Se和82Se),分别考察这6种同位素作为检测同位素时,各硒形态在ICP-MS中的响应信号强度。结果表明:等离子气氩气产生的多原子离子

36Ar38Ar＋、38Ar38Ar＋、38Ar2H＋、38Ar40Ar＋、40Ar40Ar＋、40Ar2H2＋等会干扰74Se＋、76Se＋、77Se＋、78Se＋、80Se＋、82Se＋的测定,其中,80Se＋和78Se＋受多原子离子40Ar40Ar＋的干扰最严重,且无法通过数字校正和检测条件调谐优化来消除,而40Ar2H2＋对82Se＋的干扰可通过选择碰撞池(CCT)模式和优化碰撞反应气流量消除。因此,试验选择82Se作为检测同位素。

2.4 提取方式的选择

试验考察了振荡提取、超声提取、微波萃取等提取方式对蛋白酶XIV提取灵芝中硒形态的影响。结果表明:振荡提取耗时长,提取效率低;振荡和超声都会在提取过程中产热,而蛋白酶XIV活性在高温下受抑制(蛋白酶XIV最佳酶解温度为37 ℃,80 ℃以上受热15 min失活),导致提取效率降低;微波萃取是利用电磁波产生的电磁场作用使固体或半固体物质中的目标物与基体分离,能保持目标物的原本化合物状态和有效控制蛋白酶XIV最佳酶解温度,采用微波萃取得到的硒化物的提取率高达99.2%。因此,试验选用的提取方式为微波萃取。

2.5 酶的种类和用量的选择

目前,硒形态分析的前处理方法主要有酸消解、缓冲盐提取和酶解等[11,15-16]。其中酸消解和缓冲盐提取适合用于无机硒的提取,而对有机硒的萃取效果较差,这主要是由于强酸还原能力强,样品中硒的形态易发生转变;酶解具有高效、温和、特异性强等优点,且不易发生硒形态之间的转化。基于前人研究基础[7,16-17],试验考察了胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶K、蛋白酶XIV等蛋白酶对灵芝中硒形态提取效果的影响。结果表明:微波辅助蛋白酶XIV提取灵芝中的Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、Se Met、SeCys2、SeEt、Se MeCys等6种硒形态效果最好。当灵芝样品量为1.0 g时,试验考察了不同用量的蛋白酶XIV对硒形态提取效率的影响,结果见图2。

图2 蛋白酶XIV的用量对6种硒形态提取效率的影响Fig.2 Effect of the amount of protease XIV on extraction rate of the 6 selenium species

由图2可知:随着酶用量的增大,提取液中6种硒形态的提取效率也随之增大,当蛋白酶XIV用量为20.0 mg时,6种硒形态提取效率达到最大值,且趋于平衡。因此,试验选择蛋白酶XIV的用量为20.0 mg。

2.6 标准曲线、检出限与测定下限

按照仪器工作条件对质量浓度为0.5,1.0,5.0,10.0,25.0,50.0,100.0μg·L-1的6种硒形态混合标准溶液系列进行测定,以6种硒形态的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,标准曲线的线性范围为0.5～100.0μg·L-1,其他参数见表1。

以3倍信噪比(S/N)计算方法检出限(3S/N),以10倍信噪比(S/N)计算方法测定下限(10S/N),结果见表1。

表1 线性参数、检出限和测定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度和回收试验

按照试验方法对灵芝样品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值相对标准偏差(RSD)。

6种硒形态的精密度和回收试验的结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for recovery and precision(n＝6)

由表2可知:6种硒形态的回收率为91.7%～98.7%,RSD为0.031%～3.2%,表明该方法准确度和精密度均较高。

2.8 样品分析

按照试验方法对市售赤芝、紫芝、无柄紫芝、富硒赤芝等进行硒形态分析,结果见表3。

由表3可知:受检灵芝中普遍存在Se(Ⅳ),部分灵芝样品中含有Se(Ⅵ);除了富硒赤芝外,赤芝、紫芝、无柄紫芝中的硒含量都较低,且无机硒含量小于有机硒含量;赤芝和紫芝硒成分以Se Met为主,无柄紫芝硒成分以SeCys2为主,富硒赤芝硒成分以SeCys2和SeMet为主。这说明富硒赤芝含有丰富的硒成分,且以多种硒形态存在,可作为良好的补硒产品。

表3 市售灵芝中6种硒形态测定结果Tab.3 Determination results of the 6 selenium species in commercial Ganoderma lucidum

本工作采用微波辅助酶萃取灵芝中Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、Se Met、SeCys2、SeEt、Se MeCys等6种硒形态,建立了HPLC-ICP-MS同时测定灵芝中这6种硒形态的方法。本方法具有分离效果好、检出限低、精密度高、准确度好等优点,可作为灵芝等中草药中硒形态分析的检测方法。