骨形态发生蛋白研究进展*

赵志军，赖文涛，冯士军，孙智敏，张春阳

[1.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经外科，内蒙古 包头 014010；2.包头医学院神经外科疾病研究所(转化医学)；3.内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心]

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)家族中的一员，1965年马歇尔·乌里斯首次发现BMPs的活性[1]，然而，直到20世纪80年代后期，在相继发现BMP-3、2、4之后，才更明确BMPs参与诱导骨形成的作用[2]。到目前为止，已确定识别大约20名BMP家族成员。BMPs信号通过丝氨酸/苏氨酸激酶受体，由Ⅰ型和Ⅱ型亚型组成。其中I型受体有3种，均能与BMP配体结合，即ⅠA型(BMPR-ⅠA或ALK-3)和ⅠB型BMP受体(BMPR-ⅠB或ALK-6)及ⅠA型激活素受体(ActR-ⅠA或ALK-2)[3]。Ⅱ型受体也有3种，分别是Ⅱ型BMP受体(BMPR-Ⅱ)、Ⅱ型和ⅡB激活素受体(ActR-Ⅱ和ActR-ⅡB)[4]。在这6种受体中，BMPR-ⅠA、BMPR-ⅠB和BMPR-Ⅱ是BMPs的特异性受体，ActR-ⅠA、ActR-Ⅱ和ActR-ⅡB是激活素的信号受体。这些受体在各种组织中是差异表达的。近年来，BMP配体、受体和信号分子在体内功能的研究取得了重要进展。

1 BMPs的生理功能

骨形态发生蛋白(BMPs)与多种功能密切相关。BMPs可诱导软骨和骨的形成，不仅如此，BMPs也在一些非成骨性发育过程中起重要作用。神经诱导是确定外胚层细胞分化的最早步骤。在脊椎动物中，BMPs作为表皮诱导信号，BMP-2诱导神经嵴细胞发育成神经元表型，BMP-4和7能特异性地诱导交感神经肾上腺素能的表达[5]。BMPs还能通过抑制肌生成过程，为躯体发育提供方向。在肢体芽中，BMP-2与成纤维细胞生长因子4(fibroblast growth factor4,FGF-4)和音猬因子(sonichedgehog，SHH)相互作用，从而抑制肢体芽的膨胀，诱导软骨细胞和成骨细胞前体的形成[6]。

BMPs和BMP受体信号在正常骨形成中的生理作用方面有较多研究。在小鼠颅骨表面局部注射BMP-2可跳过形成软骨阶段，直接诱导骨膜骨形成[7]。成骨细胞前体2T3细胞中显性负效BMPR-ⅠB的过度表达可抑制成骨细胞特异性基因的表达和矿化骨基质的形成[8]。以成骨细胞特异性Ⅰ型胶原启动子为靶点的BMPR-ⅠB转基因小鼠，出生后的骨形成，包括骨密度、静态骨容积和动态骨形成率均降低[9]。这些结果表明，BMP受体信号在正常出生后骨形成中起着重要的作用。

2 BMPs和BMP受体的突变

对BMPs和BMP受体自然突变的研究表明，BMPs在几种遗传性疾病中均起着重要作用。在短耳突变的小鼠中，BMP-5基因被破坏，这种突变的BMP-5基因与广泛的骨骼缺陷有关，包括长骨宽度的减少和部分椎体的大小以及整体骨骼重量下降[10]。进行性骨化性纤维发育不良(fibrodysplasia ossificians progressive,FOP)是一种非常罕见和易致残的遗传病，其特征是大脚趾的先天性畸形和进行性异位软骨内骨化，在FOP患者中发现BMP-4存在异位表达[11]。家族性原发性肺动脉高压是一种罕见的常染色体显性遗传病，其致病基因定位于染色体2q33，肺小动脉内皮细胞丛洋病变是本病的主要表型。这种病变能导致肺动脉压力升高，引起右心室衰竭甚至死亡。在对此病的多个家族系进行基因分型后发现，患者中均存在BMPR-Ⅱ基因突变[12]。不仅如此，BMP-2、BMP-4和BMP-5的过度表达与口腔上皮的恶化有关[13]，前列腺癌细胞中也发现有BMP-2和BMP-3的过度表达[14]。

3 BMPs、BMP受体和SMADs的无效突变

为确定BMP配体、受体和信号蛋白在胚胎发育和出生后发挥的作用，对已经产生了BMP配体、受体和Smad基因的无效突变动物和它们的表型变化进行了广泛的研究。缺乏BMP-2和BMP-4的小鼠是不能存活的。纯合子BMP-2突变胚胎在胚胎发育的第7.5 d(E 7.5)～10.5 d(E 10.5)之间死亡，并且心脏发育存在障碍，表现为心脏在外胚层中的发育异常[15]；纯合子BMP-4突变胚胎在E 6.5～E 9.5之间死亡，这种胚胎几乎没有中胚层的分化[16]；BMP-7缺陷小鼠出生后不久就因肾脏发育不良而死亡。突变胚胎在几个发育阶段的组织学分析表明，肾后间充质细胞的分化障碍，导致新生肾脏几乎没有肾小球。此外，BMP-7缺陷小鼠的视力障碍似乎起源于晶状体诱导[17]。然而，缺乏BMP-6的小鼠是可行的和可育的，并且在已知表达BMP-6 mRNA的组织中没有明显的缺陷[18]。BMP-6主要表达于增生性软骨，由于BMP-2和BMP-6在组织中存在协同表达，BMP-2可在功能上补偿因BMP-6无效突变引起的BMP-6缺失的问题。

BMPR-ⅠA基因的无效突变导致小鼠胚胎在E 9.5死亡，并且在E 7.5首次检测到具有形态缺陷的纯合子突变体：突变胚胎中没有中胚层的形成[19]，这表明BMPR-ⅠA是诱导过程中导致中胚层形成的关键因素。

缺乏BMPR-ⅠB的小鼠是可行的，它们仅在附肢骨骼中表现出缺陷。在BMPR-ⅠB缺失小鼠中，指骨区软骨前细胞增殖和软骨细胞分化明显减少；在成年突变小鼠中，近端指间关节缺失，指骨被单一基本元素所取代，而远端指骨不受影响。桡骨、尺骨和胫骨的长度正常，但掌骨和跖骨的长度减少[20]。BMPR-ⅠB突变小鼠的附肢缺损与GDF-5位点的等位基因GDF-5bp-j缺失纯合子小鼠相似，GDF-5在软骨形成中有关键作用，并且与BMPR-ⅠB具有较高的亲和作用[21]，表明BMPR-ⅠB在体内软骨形成中也起着重要作用。

BMP配体可利用多种Ⅰ型BMP受体介导其在软骨和骨形成过程中的信号传递。在BMPR-ⅠB和BMP-7双突变小鼠中，前肢和后肢均出现了严重的附肢骨骼缺损：尺骨几乎消失，桡骨缩短[22]。由于BMP-7与BMPR-ⅠB和ActR-ⅠA(Alk2)能有效结合[23]，所以BMPR-ⅠB和ActR-ⅠA(Alk2)在体内软骨和骨形成中起着重要的协同或重叠作用。

Smad1无效突变小鼠死于E 10.5，因为它们无法与胎盘连接。Smad1突变胚胎表现为内脏后内胚层、胚外外胚层和绒毛膜中胚层的过度生长。Smad1突变胚胎中尿囊的过度生长效应导致该组织的大小和形态急剧降低，同时也导致无法与胎盘形成有效连接[24]。纯合子Smad5缺失突变小鼠在妊娠E 10.5～E 11.5期间因血管生成障碍而死亡。突变的卵黄囊缺乏正常血管，且血细胞分布也不规则。这种突变胚胎不仅血管扩张，而且血管平滑肌细胞数量也减少[25]。这些发现表明Smad5可能在血管生成过程中调控内皮-间充质相互作用。

4 对BMP信号的负调控

BMPs对骨形成和其他细胞功能有较强刺激作用。这些作用体现在BMPs的活性受不同分子水平的控制：(1)一系列BMP拮抗剂结合BMP配体，从而抑制BMP功能；(2)Smad6是Smad家族的成员，它结合Ⅰ型BMP受体，阻止Smad1和Smad5的结合和磷酸化；(3)Tob是一种抗增殖蛋白，它选择性地结合Smad1和Smad5，抑制成骨细胞中的BMP信号；(4)Smad泛素调节因子1(Smurf1)是E3泛素连接酶，它与Smad1和Smad5相互作用，并介导这些Smad蛋白的降解。

BMP拮抗剂的突变表明，在特定的系统中，BMPs的活性很重要。例如，近端指间关节畸形(proximal symphalangism，SYM1)是一种常染色体显性疾病，表现为手指近端指骨间关节强直、腕骨和跖骨融合，部分病例表现为传导性听力丧失。这些症状与另一种关节形态障碍疾病—多发性滑膜炎综合征有共同之处。据报道，这两种疾病都是由人类noggin基因的杂合突变引起的。Noggin是一种分泌多肽，它与BMP-2、BMP-4和BMP-7结合并使它们失活，通过阻断Ⅰ型和Ⅱ型BMP受体结合表位的分子界面抑制BMP信号。每个BMP-7单体上的Ⅰ型和Ⅱ型受体结合区与二聚体noggin复合物的特定剪接片段相互作用，从而阻止BMP-7与BMP受体结合[26]。到目前为止，已从与关节形态发生有关的不相关家族中发现7种noggin基因突变[27]。

硬化症是一种隐性遗传骨硬化性疾病，由硬化蛋白突变引起。这种疾病最初被认为是骨质疏松症的变体[28]，但随后的代谢研究表明,其主要是由于骨形成增加，而不是骨吸收障碍导致[29]。研究还发现，硬化蛋白与BMP拮抗剂家族有一定联系，其中包括Noggin、Chordin、Gremlin和Dan。硬化蛋白在成骨细胞和骨细胞中表达，与BMP-5、BMP-6和BMP-7结合，并具有较高的亲和力。硬化蛋白在多能成纤维细胞C3H10T1/2中的表达阻断了成骨细胞的分化，而转基因小鼠成骨细胞在骨钙素启动子的控制下，硬化蛋白的过度表达则引起骨质疏松[30]。这些研究表明，激活内源性BMP信号可促进骨形成，并且出生后正常骨形成也必须经过BMP活性的调控。

Tob是一种新型抗增殖蛋白家族成员，包括Tob、Tob2、BTG1、BTG2和BTG3。Tob通过与Smad1和Smad5蛋白的结合，抑制BMP诱导的成骨细胞中Smad依赖性转录。在Tob基因敲除小鼠中，BMP-2信号增强，BMP-2对成骨细胞增殖和分化的影响增加，同时也对BMP-2诱导的局部骨形成有促进作用[31]。

调节BMP信号蛋白活性的另一个重要机制是由泛素介导的蛋白酶体降解机制。泛素-蛋白酶体蛋白水解途径在细胞周期进程、基因转录和信号转导等各种重要生物过程中起着至关重要的作用[32]。泛素-蛋白质结合物的形成需要三种酶参与泛素转移反应的级联反应：泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。蛋白质泛素化的特异性由E3泛素连接酶决定，它在确定底物特异性和26S蛋白酶降解蛋白质中起着重要作用[33]。

5 BMP-2的治疗利用

BMP-2的诱导成骨能力已在临床前模型中得到证实。许多用于评估BMP-2治疗骨缺损能力的动物模型都使用了临界大小的骨缺损。这种设置有助于分析BMP-2诱导骨的能力。在包括大鼠、兔、狗、羊和非人类灵长类动物在内的物种中，BMP-2也能用于治疗长骨临界大小的骨缺损[34]。基因治疗研究表明，骨缺损是通过植入一种与骨髓间充质干细胞混合的可吸收聚合物来愈合的，也就是植入腺病毒BMP-2[35]。在两种不同的小鼠模型中，rhBMP-2的全身性给药增加了间充质干细胞的活性，并逆转了卵巢切除引起的与年龄相关的骨丢失[36]。这些结果表明，BMP-2可用于治疗骨质疏松症。还有研究表明，以磷酸钙或脂质体载体注射rhBMP-2，能加速兔尺骨截骨模型和大鼠股骨头缺损模型的骨愈合进程[37]。除此之外，rhBMP-2还可作为脊柱融合手术中完整的骨移植替代物，在某些情况下，BMP-2诱导成功融合的疗效甚至优于自体骨移植。BMP-2在多种临床应用中被证明有效，包括椎间和腰椎后外侧融合[38]、诱导新的牙本质形成[39]，并有潜在的应用作为根管手术的替代物，BMP-2还是一种有效的种植体周围骨诱导剂，能应用于牙周重建[40]。

虽然近年来在了解BMP信号在体内的作用方面取得了显著的进展，但由于大多数BMP配体、受体和信号分子的缺失都可能产生致命的表型，所以仍需对单个BMP配体、受体和信号分子进行组织特异性敲除，以进一步确定BMP信号在特定组织中的特定作用。通过生成BMP配体、受体和信号分子的组织特异性和可诱导的条件敲除等位基因将使我们进一步了解关于BMP信号在出生后和成年动物中的生理功能。