循环游离DNA在肝细胞癌诊断和治疗中的应用

杨裔坚， 付必莽， 谢 楠， 曹 凡， 苏莹珍

1 昆明医科大学第二附属医院 肝胆外科， 昆明 650032; 2 昆明学院 医学院， 昆明 650200

肝癌是全球范围内第6大最常见的癌症和第4大癌症相关死亡原因[1]。肝癌恶性程度高，早期诊断率低，发病率与病死率的比率接近1，2015年大约有854 000例新发肝癌病例，而每年估计有810 000例肝癌相关死亡[2]。肝细胞癌(HCC)约占原发性肝癌的75%～85%，是全世界主要的健康问题[3]，在我国癌症相关死亡率中排名第3位[4]。手术切除是HCC患者最重要的治疗方法，但由于缺乏早期有效诊断方法，多数患者初次确诊已是晚期，只有20%～30%的患者可接受手术干预，且术后5年内的复发率高达50%～70%[1]。早诊断、早治疗是HCC治疗的重点。血清AFP和肝脏超声是目前应用最广泛的HCC筛查方法，但两者的敏感度(25%～65%、60%)均不理想[5]。此外，术前穿刺检查也存在一定局限性。近年来，液体活检已成为诊断癌症的辅助手段，具有非侵入性、可频繁检查的优势，可以在治疗期间更好地监测疾病进展和基因突变，也可以用来验证癌症治疗药物的效果[6]。循环游离DNA(circulating free DNA，cfDNA)是液体活检的重要组成部分，早在1948年Mandel等[7]便对其进行了描述，此后研究发现肿瘤患者血液中含有肿瘤来源的cfDNA，被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。由于cfDNA含有点突变、拷贝数变异、染色体重排和甲基化等信息，被视为具有前途的生物标志物[8]。近年来，cfDNA在肺癌、乳腺癌、大肠癌、膀胱癌中的诊断与预后分析价值逐渐显现，相关检测工具逐步开发，目前美国食品药品监督管理局已正式批准液体活检用于癌症检测。本文现就cfDNA在HCC诊断和治疗中的研究进展做一综述。

1 cfDNA的生物学特性

1.1 cfDNA的来源 cfDNA是细胞外双链DNA分子，由小片段(70～200 bp)和较大片段(21 kb)组成[9]。所有细胞(包括肿瘤细胞和非恶性细胞)均释放cfDNA到循环系统中，其中癌症和其他疾病(如肾衰竭和心肌梗死)患者cfDNA水平往往高于健康人群[10]。cfDNA分子的遗传和表观遗传修饰反映了起源细胞的基因组或表观基因组，甲基化分析表明，大多数血浆cfDNA从健康个体的造血细胞中释放而来，人体经过高强度运动后，造血细胞释放大量cfDNA[11-13]。ctDNA的来源目前尚不清楚，大多数ctDNA被认为来源于凋亡和坏死的肿瘤细胞，这些细胞将其碎裂的DNA释放到血液循环中，DNA也可能通过活的肿瘤细胞作为游离 DNA分泌，或者通过吞噬细胞吞噬肿瘤细胞后分泌[14-16]。

1.2 cfDNA的种类 (1)DNA片段：游离DNA片段不与任何其他分子或表面结合。释放后，它们会被血液中的DNA酶消化。在癌症患者血液中DNA酶浓度较低，同时可检测到DNA酶抑制剂，可能导致cfDNA水平的升高[17]。(2)核小体：在细胞凋亡过程中，染色质被切割成寡核小体和单核小体，包装成囊泡，并在被邻近细胞吞噬之前从细胞中释放出来。在癌症患者化疗或放疗期间，细胞死亡率较高，吞噬机制趋于饱和，导致循环中核小体水平升高[18]。(3)囊泡DNA：囊泡DNA包括凋亡小体、外泌体和细胞微粒中的DNA，核酸被包装在这些小体中，并从细胞中释放出来，由吞噬细胞摄取[19]。Holmgren等[20]证实，凋亡小体可以被吞噬细胞吸收，导致DNA的水平转移。外泌体是由许多类细胞产生的小泡，它们可能含有核酸和蛋白质，肿瘤细胞释放的外泌体含有突变的核酸片段，可能有助于原发性和转移性癌症的生长和传播[21]。

2 cfDNA的检测方法

最常见的cfDNA检测方法包括数字PCR(digital PCR, dPCR)、下一代测序技术(next generation sequencing, NGS)和扩增阻滞突变PCR(amplification refractory mutation system, ARMS PCR)。

2.1 数字PCR(dPCR) 最初用于cfDNA定量的方法以定量PCR和PCR相关方法为主，可以在大量野生型DNA存在的情况下，优先扩增低水平的突变等位基因。研究[22-23]发现，各种类型癌症患者血浆中KRAS或APC等基因存在体细胞突变，同时基于PCR的方法可以检测cfDNA的微卫星改变。然而，这些方法的主要限制在于对早期疾病患者或对治疗有反应的晚期患者的cfDNA检测时不够敏感。相较而言，dPCR能够更加精确地定量小突变等位基因组分，目前通过dPCR进行cfDNA分析的主要技术有BEAMing和微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)，这些方法允许非常精确地计数携带目标突变的总模板分子的数量，并可达到0.01%的检测极限[24]。曹喆等[25]使用ddPCR检测晚期肺腺癌患者外周血中ctDNA中肿瘤表皮生长因子受体基因突变，发现其与肿瘤组织该基因突变结果的符合率为82.4%，敏感度为74.1%，特异度为90.2%，支持其应用于临床。dPCR是目前检测cfDNA内特定突变的金标准，然而该技术最大的限制是每次只能检测1个或者少数突变。由于许多患者体内的cfDNA浓度较低，意味着为了评估少数突变通常需要采集10～20 ml血液，此外，为了使用dPCR来监测肿瘤患者的治疗反应，首先需要通过获取肿瘤组织来确定至少1个突变，因此通常需要最初的侵入性操作[26]。

2.2 下一代测序技术(NGS) 不同于dPCR，NGS允许对单个样本中数百万个DNA片段进行大规模平行测序，提供了一次性对许多潜在突变进行基因分型的可能性。NGS通常被用于对热点基因测序以获得肿瘤的遗传信息，以便通过深度测序进行癌症个性化分析，其对cfDNA的分析是临床肿瘤学中一种有价值的工具。Li等[27]多次使用NGS技术检查非小细胞肺癌患者ctDNA中基因拷贝数变化，先后检测发现EGFR L858R和扩增变异、新增c-MET扩增、NRAS Q61H和KRAS G12D变异，而后在临床治疗中分别给予相应分子靶向药物治疗，取得了满意的治疗效果。然而，在NGS成为常规使用的临床检验工具之前，其检测极限仍需改进。目前，阻碍NGS精确检测的限制主要包括：(1)敏感度低，分析血液中微量的ctDNA具有挑战性[28]。(2)在测序和后续分析过程中，可能获得假阳性或假阴性结果[29]。

2.3 扩增阻滞突变PCR(ARMS PCR) ARMS是一种等位基因特异度PCR联合荧光探针的新型技术，基于实时PCR平台结合特异引物和双环探针检测DNA样品中含有的突变基因。Feng等[30]研究表明，ARMS PCR检测肺癌患者血浆EGFR突变的敏感度与ddPCR相似(76.5% vs 80.4%)，特异度相似(100% vs 89.3%)。Li等[31]研究发现，ARMS PCR在晚期肺癌患者cfDNA的EGFR突变检测中具有较高的敏感度和特异度，支持其在临床上作为组织活检的补充或替代方法。然而，ARMS技术检测敏感度有限(检测限度为1%)，单次只能检测单个基因且只能用于检测已知突变，在一定程度上限制了其应用[32]。

3 cfDNA在HCC中临床应用价值

3.1 cfDNA在HCC诊断中的应用 肝癌患者cfDNA水平较健康人群升高，并随肿瘤负荷动态变化[33]。Jiang等[34]开展了大规模平行测序，以单碱基分辨率和全基因组方式对90例HCC、67例慢性乙型肝炎、36例乙型肝炎肝硬化和32例健康对照者的血浆cfDNA大小进行了详细分析，结果显示，HCC的诊断敏感度为80%，特异度为94%，受试者工作特征曲线下面积为0.93，发现HCC患者血浆中存在异常短和长的cfDNA分子片段，较短的片段优先携带与肿瘤相关的拷贝数畸变。Kisiel等[35]使用靶富集长探针定量扩增信号(TELQAS)的NGS测定HCC患者cfDNA中的6个甲基化标志物，诊断敏感度为95%，特异度为92%，受试者工作特征曲线下面积为0.96。另有研究[36]表明，对于早期局限性肿瘤而言，血浆cfDNA的液体活检敏感度是有限的，单独使用cfDNA对肝癌的最大检测能力仅为60%，但基于NGS和 HiSeq 4000测序系统的开发的CancerSEEK液体活检技术，采取综合cfDNA突变与肿瘤抗原水平的算法，能够早期预测卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、结直肠癌、肺癌与乳腺癌等8种最常见癌症，且能精准定位原发癌灶，其中肝癌的敏感度95%，特异度99%。

3.2 cfDNA在HCC预后中的应用 Xu等[37]研究发现，ctDNA甲基化标志物除了在HCC诊断中具有较高的敏感度和特异度，还与患者的肿瘤负荷、分期、治疗反应和预后相关，此外，由于其相对较短的半衰期(约2 h)，可以快速地调整基于ctDNA的治疗计划。Li等[38]选取155例肝癌手术切除患者、60例慢性乙型肝炎患者和20例健康对照者，使用甲基化特异度PCR测定cfDNA Marker-IGFBP7启动子甲基化，结果显示，HCC患者IGFBP7启动子甲基化是总生存期的独立预后预测因子(HR=3.864，95%CI：2.073～7.203，P=0)，与早期肿瘤复发有关(P=0.001)。Marchio等[39]通过HCC患者cfDNA检测P53基因的R249S突变，发现突变患者通常表现出明显增加的循环AFP水平、高HBV DNA载量以及血细胞计数值恶化，提示其与疾病严重度相关。另一项研究[40]中，30例HCC患者中7例肿瘤直径>5 cm或有转移，其中6例患者cfDNA至少检测到1个突变。在这些患者的cfDNA和肿瘤组织DNA中分别检测到87%(80/92)和95%(87/92)的突变，表明cfDNA和肿瘤组织DNA的体细胞突变率相似，结果表明，肿瘤突变负荷和突变等位基因数量与肿瘤大小和分级有关。

3.3 cfDNA在HCC监测和治疗评价中的应用 目前，临床主要通过影像学和AFP评估肿瘤治疗反应，但AFP敏感度较差，应用价值受限。cfDNA分析肿瘤的分子变化对于指导适当的靶向治疗是很重要的，此外还可能有助于监测治疗反应，因为血浆中的突变状态反映了患者的肿瘤负荷，并与患者的临床状况相关[41]。Ikeda等[42]对26例HCC患者进行32次cfDNA NGS分析，检测到54～70个基因中的单核苷酸变异、扩增、融合和特异度插入/缺失改变，88.5%的患者具有至少1个特征性改变，所有患者均有至少1个潜在可以采取治疗措施的突变，最常见的突变基因为P53(16/26，61.5%)；1例使用卡培他滨治疗患者的连续ctDNA评估显示，在疾病进展后出现了一种新的P53突变，表明cfDNA用于HCC耐药性检测是可行的，可以无创获得潜在的可采取治疗措施的突变和潜在的分子靶向治疗的信息，并可以观察肿瘤基因随着治疗策略的突变情况。Cai等[43]在综合治疗过程中监测了1例HCC患者，观察到即使在影像诊断和第1次TACE治疗AFP水平增加之前，含有8个体细胞突变信息的cfDNA水平便已升高，在此过程中，1个错义体细胞突变在第1次TACE治疗后被发现，第2次手术后无法检测到，而在第2次复发时却急剧增加。上述研究表明，cfDNA可以实时跟踪不同突变体的变化和治疗反应。

此外，ctDNA中检测到的体细胞突变可以指导治疗。1例晚期HCC患者由于1个CDKN2A基因失活和1个CTNNB1基因激活突变接受哌柏西利(CDK4/6抑制剂)和塞来昔布(COX-2/WNT抑制剂)治疗，2个月后，γ-羧基凝血酶原水平下降84%(1410 ng/ml降至242 ng/ml)，AFP低于基线水平。1例PTEN基因失活和MET基因激活突变的晚期HCC患者接受西罗莫司(雷帕霉素靶蛋白mTOR抑制剂)和卡博替尼(MET抑制剂)后，AFP水平下降63%(8320 ng/ml降至3045 ng/ml)[44]。提取肝癌患者血液中的cfDNA可以提供可利用的基因组图谱，并在药物治疗方面提供指导。

早期诊断仍然是提高肝癌治愈率的关键，然而在肿瘤发生的早期阶段，血浆中cfDNA含量较低，无法提供可靠的诊断信息。由于ctDNA的甲基化变化发生在肿瘤形成的早期，并且具有潜在的可逆性，同时cfDNA不同的甲基化组合展现出优异的敏感度和特异度，因此cfDNA甲基化在HCC早期诊断中具有前景。目前的研究大多采用不同的技术和检测标准来检测cfDNA，从而产生不同的敏感度和特异度，因此标本采集处理、cfDNA的提取及检测必须标准化。cfDNA在诊断上具有较高的特异度，其联合多标志物分析则可以提高肿瘤诊断特异度，多种cfDNA甲基化标志物组合与肿瘤抗原相结合还可进一步提升诊断效果。现有文献报道的大多数数据来自亚洲国家，研究结论的通用性可能有限，因为性别和种族对DNA甲基化模式有显著影响。肝癌的不同病因可能影响肝癌的DNA突变谱，cfDNA确切的来源目前尚不清楚。因此，未来需要更多的基础研究，明确cfDNA的生物学特性，针对不同病因、不同地域、不同种族患者进行横向研究。通过提高仪器的精确性和易用性，同时联合生物信息学、大数据等多平台优势改善检测的敏感度。相信未来以cfDNA为代表的液体活检技术将在HCC诊断和治疗领域大放异彩。

作者贡献说明：杨裔坚负责课题设计，资料分析，撰写论文；谢楠、曹凡参与搜索论文资料，修改论文；付必莽、苏莹珍负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。