非编码RNA与血脂代谢的研究进展

林振浩（综述） 唐敏娜 胡嘉禄 颜 彦（审校）

（复旦大学附属中山医院心内科 上海 200032）

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，起始于机体对血管内皮损伤的反应，随后发展至血管壁脂质沉积和持续性的炎症反应［1］。基于动脉粥样硬化发生发展的“炎症”和“脂质沉积”学说而开发的抗炎和降脂药物目前已成为临床上治疗动脉粥样硬化的基石。然而，单纯的药物抗炎和降脂作用越来越有限，而且一些患者已经表现出耐药性。因此，需要探究动脉粥样硬化发生发展更深层次的调控过程，从而为临床提供更加有效的预防动脉粥样硬化的方法。

2000年人类基因组计划宣布完成，人类基因组约30亿碱基对中编码蛋白质的DNA片段所占比例不到5%，非编码序列占主要成分。2003年启动的DNA元件百科全书的项目（encyclopedia of DNA elements，ENCODE）用了9年时间证明，人类基因组中约80%的DNA具有功能，非编码RNA参与的表观遗传调控过程或许才是导致功能差异的主要变量［2］。表观遗传调控过程在血脂代谢和动脉粥样硬化的发生发展中起着重要作用［3］。除了传统的DNA及组蛋白的甲基化和去甲基化，非编码RNA，即微小RNA（micro RNA，miRNA）、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、环状 RNA（circularRNA，circRNA）等参与的复杂多变的调控过程对于血脂代谢和动脉粥样硬化的发生发展更为重要［4-7］。这些发现为降低血脂和预防动脉粥样硬化提供了更加具体的靶点，并为临床开发新的治疗方式提供了理论基础。

miRNA与血脂代谢miRNA是长度为18～24个核苷酸的单链RNA片段，物种之间具有高度的保守性，通过与靶基因mRNA的3′-UTR结合，阻断mRNA的转录或引起mRNA的降解，从而导致蛋白表达的降低［8-10］。哺乳动物体内超过50%的编码蛋白的基因，其mRNA受miRNA的调控［11］。miRNA与mRNA之间的特殊作用模式，使得单个miRNA可以调控多种蛋白的表达，而同一种蛋白的表达也可以受到不同种miRNA的调控，从而形成miRNA复杂的调控网络。miRNA导致蛋白表达下调的这种沉默效应，使得基于miRNA的治疗方法具有巨大的研究价值，研究者既可使用miRNA增强剂下调某种蛋白的表达，也可使用miRNA拮抗剂上调某种蛋白的表达［12］。miRNA在低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDLC）的代谢过程中发挥至关重要的作用，大量体内外实验已经证实miRNA可以通过调节LDL受体（LDL receptor，LDLR）、载脂蛋白B（apolipoprotein B，apoB）和前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）的表达而控制血浆LDL-C水平［13］。通过miRNA增强剂或拮抗剂对低密度脂蛋白代谢过程中的相关miRNA进行调节，是一种具有巨大潜力的治疗策略。

体外细胞实验研究表明，大量miRNA（如miR-27a、miR-27b、miR-130b、miR-148a、miR-185和miR-301b）均可通过靶向作用于LDLR mRNA的3′-UTR而调节LDLR的表达，其中miR-148a和miR-185已在体内实验中被证实可降低血浆LDL-C水平［14-15］。PCSK9通过与肝脏上的LDLR结合，促进LDLR降解，从而参与LDL-C代谢，影响血浆LDLC水平，而编码PCSK9的基因序列发生变化可使血浆LDL-C呈低浓度水平，并降低冠心病的发病率［16］。研究发现miR-224可直接靶向PCSK9 mRNA并显著下调其表达，多种miRNA（如miR-18a-5p、miR-148、miR-323-5P、miR-570、miR-584t、miR-663-b、miR-922、miR-3919、miR-3974、miR-4509、miR-4690-5p、miR-4732-5p、miR-4795-5P、miR-5586-3P和miR-6134等）均被预测可与PCSK9 mRNA的3′-UTR结合，进而下调PCSK9的表达［17-18］。apoB存在于低密度脂蛋白的表面，细胞识别和摄取LDL-C主要通过识别apoB实现，高水平apoB常见于高脂血症，有研究证实miR-34a、miR-30c和miR-122参与apoB代谢，可降低血脂水平［19-21］。在血脂代谢方面，大量miRNA可通过影响LDLR、PCSK9和apoB等蛋白的表达而影响血脂代谢，这为治疗高脂血症、防止动脉粥样硬化提供了潜在的治疗靶点。

siRNA与血脂代谢除了miRNA通过作用于靶基因mRNA的3′-UTR而介导的RNA干扰（RNA interfering，RNAi）外，经过设计的外源siRNA介导的RNAi是一种更为成熟、应用更为广泛的技术。siRNA是一个长度为20～25个核苷酸的双链RNA，每条链各有1个磷酸化的5′末端和一个羟基化的3′末端，其中一条称为正义链，另一条称为反义链。利用一种称为Dicer的酶处理得到此结构，这种酶可以将较长的双链RNA或短发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）切成siRNA。由正义链和反义链组成的双链siRNA通过与RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合后激活RISC，随后siRNA的正义链被RISC的内切酶Argonaute 2（AGO2）切割掉，剩下的反义链将活化的RISC引导至靶基因的mRNA，siRNA的反义链与靶基因的mRNA互补结合，从而特异性介导基因沉默［22］。正是因为siRNA有这种基因沉默作用，有时候siRNA也被称为沉默RNA（silencing RNA）。

得益于siRNA的特殊作用机制，通过将设计的外源siRNA转染至细胞或动物体内而获得某种基因功能缺失的方法已被广泛应用于细胞和动物实验中，而基于siRNA的疗法已被证明对心血管疾病有巨大的治疗潜力［23］。动物实验中，以翻译apoB的mRNA为靶点的siRNA可明显降低小鼠和灵长类动物血液中LDL-C水平［5］。临床试验方面，ORION-1研究［24］使用了基于siRNA的PCSK9抑制剂Inclisiran，共纳入497例患者，随机分配成单次注射治疗组（n=251）和双次注射治疗组（n=241），每组再随机分为4个亚组，单次注射治疗组分别给予安慰剂或注射Inclisiran 200、300、500 mg，双次注射治疗组分别给予安慰剂或注射Inclisiran 100、200、300 mg。从第一次注射给药到最后一次随访，共计360天，分别在第14、30、360天进行随访，在第180天进行一次主要评估，双次注射治疗组在第90天进行第二次给药。结果显示：单次注射Inclisiran 300 mg，第60、180、360天分别观察到LDL-C下降50.9%、38.6%、19.0%（P均＜0.000 1）。双次注射Inclisiran 300 mg，第150、180、360天分别观察到LDL-C下降55.5%、52.5%、31.4%（P均＜0.000 1）。在随访的360天内没有发现安全性问题，随机药物组总体不良事件发生率、瞬时转氨酶升高的发生率与安慰剂组类似，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶升高发生率亦无差异。

虽然目前基于siRNA的RNAi技术还存在脱靶效应以及准确递送的问题［25］，但是动物研究和临床试验都进一步证实该方法降脂的有效性。随着研究的深入，对siRNA作用的认识不断加深，基于siRNA的RNAi技术可能会成为临床上有效预防动脉粥样硬化的一种方法。

lncRNA与血脂代谢lncRNA是一种长度大于200个核苷酸且不编码蛋白的RNA，第一个被报道发现的lncRNA是H19，随后Cell于1992年同期发表了两篇文章报道lncRNA Xist。随后的十几年里，miRNA和siRNA一直是非编码RNA家族里被研究的主角，但lncRNA的研究却一直呈缓慢进展的状态，直至2012年ENCODE计划完成后，大量lncRNA才陆续被发现。miRNA和siRNA最主要的作用机制是沉默靶基因，比较单一，而lncRNA的作用机制复杂多样，不仅参与调控基因的转录和翻译过程，还作为信号分子参与细胞内信号传导，作为分子诱饵阻断某些生物学过程，甚至作为分子支架协调细胞内的各种分子间的交互［26］。正是由于lncRNA复杂多样的作用机制，其参与的生物学过程更广泛，lncRNA很有可能会成为分子生物学里的支柱型分子之一［27］。

最新研究发现，lncRNA与心血管疾病的发生发展有密切联系：lncRNA MIAT与心肌梗死相关，而lncRNA LIPCAR与心脏重塑和慢性心力衰竭相关［28-30］。在心肌梗死患者中，lncRNA aHIF、lncRNA KCNQ1OT1、lncRNA MALAT1表达增加，而lncRNA ANRIL表达下调［31］。在血脂代谢及动脉粥样硬化的发生发展方面，lncRNA也发挥重要作用：lncRNA lnc肝脏特异性三酰甘油调节因子（liver-specific triglyceride regulator，LSTR）与三酰甘油的代谢密切相关，lncLSTR敲除小鼠血液中三酰甘油水平明显下降，而载脂蛋白C2（apolipoprotein C2，apoC2）的表达水平明显上升，apoC2能够激活脂蛋白脂酶，进而提高血三酰甘油的清除率［32］；lncRNA载脂蛋白A1（apolipo-protein A1，apoa1）-反义转录物（antisense，AS）是apoa1基因的负转录调控因子，apoa1-AS通过与apoa1基因结合抑制其表达，从而降低外周血apoa1水平［33］；lncRNA DYNLRB2-2能够通过胰高血糖素样肽-1受体（glucagon-like peptide 1 receptor）信号通路上调G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor 119，GPR119）及ATP结合盒转录子A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）的表达，其中GPR119的激活能够抑制来源于THP-1巨噬细胞的泡沫细胞内的炎症，而ABCA1的激活则介导胆固醇的逆向转运，即将肝外组织细胞内的胆固醇通过血液循环运回到肝脏，在肝脏中进行代谢转化再排出体外的过程，DYNLRB2-2通过上述一系列过程参与调控胆固醇代谢及动脉粥样硬化的形成过程［34］。研究发现lncRNA Lexis能够通过阻断转录激活因子与羟甲基戊二酸单酰辅酶还原酶（HMGCoA reductase，HMGCR）基因的结合，抑制胆固醇的合成，而HMGCR正是他汀类药物的作用靶点。一项利用Lexis基因治疗家族性高胆固醇血症小鼠的研究发现，经过治疗的小鼠患动脉粥样硬化的比例明显降低［35-36］。肝脏组织高表达的lncRNA HULC、lnc-HC和脂肪组织高表达的类固醇受体RNA激活因子（steroid receptor RNA activator，SRA）、Blnc1、lnc-BATE1、NEAT-1均与血脂代谢及动脉粥样硬化的发展有密切关系［37］。

得益于高通量测序技术的迅速发展，lncRNA的研究获得了突飞猛进的进步，随着越来越多的lncRNA被发现，对其在血脂代谢方面作用机制的认识不断深入，lncRNA有望成为预防动脉粥样硬化的新的作用靶点。

circRNA与血脂代谢circRNA是形成共价闭环的单链RNA，结构稳定且在机体内含量丰富，近年来由于生化方法的快速进步和高通量测序技术的使用，越来越多的circRNA被发现和分离出来，目前已知的circRNA超过32 000个［38］。circRNA与机体的许多生理和病理过程相关，在转录和转录后水平的调控上发挥重要作用：circRNA可与一些miRNA结合，抑制miRNA的功能，该作用被称为miRNA海绵（miRNA sponge）；circRNA可控制mRNA的可变剪切以及亲本基因的表达［39］。许多circRNA都来自于与心血管疾病相关的基因，在健康和患病的心脏中存在表达差异，提示其在疾病的发展过程中或许发挥一定的作用［40-41］。心肌梗死相关circRNA（myocardial infarction-associated circRNA，MICRA）在心肌梗死患者的外周血样中下调，MICRA水平低的患者易出现左心功能不全，在经皮介入治疗后再灌注时发生左心功能不全的风险比较高，这提示外周血MICRA水平可作为心梗患者左室功能发展不全的预测因子［42-43］。在缺氧心肌细胞和心梗小鼠模型中，circRNA CDR1as表达上调，体内CDR1as的过表达可促进心梗面积增加［44］。在血脂代谢方面，同样有circRNA的参与，circANRIL与动脉粥样硬化发生发展密切相关，主要起到抗动脉粥样硬化的作用［7］。研究者使用来自12例冠心病患者和12例对照个体的外周血样进行circRNA微阵列分析，发现hsa_circ_0082081和hsa_circ_0124644与冠心病中度相关，而hsa_circ_0113854和hsa-circRNA5974与冠心病弱相关。hsa_circ_0124644作为冠心病外周血样品的生物标志物时，灵敏度和特异度分别为86.1%和62.6%［45］。冠心病相关的circRNA或许在与动脉粥样硬化形成相关的血脂代谢方面发挥一定的作用。

虽然目前已知的circRNA比较多，但是对心血管疾病（特别是与血脂代谢异常和动脉粥样硬化）发生发展相关的circRNA研究还不多，鉴于circRNA特殊的结构及作用机制，其可能会成为预防动脉粥样硬化的作用靶点。

结语血脂代谢异常是促进动脉粥样硬化发生发展的重要因素之一，人类基因组计划和ENCODE计划的完成使我们从非编码RNA的角度对血脂代谢异常有了新的认识，无论是miRNA、siRNA参与的基因沉默效应，还是lncRNA、circRNA参与的多种复杂调控过程，都会对血脂代谢产生巨大影响，从而影响动脉粥样硬化的发生发展。得益于全新的的生化方法和高通量测序的迅猛发展，未来对于非编码RNA与血脂代谢的关系一定会有全新的认识，从而为临床预防和治疗动脉粥样硬化、降低冠心病发病率提供更加安全可靠的方法。