白藜芦醇对松辽黑猪精液冷冻的影响

2020-12-11菅芯蕊张志彬张绍萱于永生罗晓彤李兆华

猪业科学 2020年7期

菅芯蕊，张志彬，王珺，张绍萱，于永生，罗晓彤，李兆华＊

（1. 吉林省农业科学院畜牧科学分院，吉林公主岭 136100；2. 延边大学农学院畜牧学系，吉林延吉 133002；3. 吉林大学动物科学学院，吉林长春 130062）

现阶段畜禽生产中，由于冷冻精液具有贮存时间长，可减少动物传染病传播，经济效益高等优点，使得冷冻精液技术得到了快速发展，但是对于当前行业发展需求来说，猪冷冻精液的发展仍有很大的空间。氧化应激是影响解冻后猪精液品质下降的主要原因。冷冻精液解冻后精液中的氧化应激，主要是因为过量的活性氧（ROS）攻击精子。过量的ROS主要引起精子的脂质过氧化（lipid Peroxidation）和 DNA片段化[1]。使精子畸形率上升，精子活率、精子运动速率等下降，最终导致受胎率、产仔率下降，流产率、胎儿畸形率上升。为了减弱ROS对精子的影响，研究人员尝试加入抗氧化剂后，发现具有较好的效果。

X. G. Weng等[2]研究发现在冻存的公猪精液中添加黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）可以提高精子的抗氧化水平，改善体外受精（in vitro fertilization，IVF）参数和胚胎发育的结果。S. K.Baishya等[3]在冷冻基础液中补充谷胱甘肽、维生素E和丁基化羟基甲苯，试验后发现其可以显著提高精子解冻后的活力，使精子顶体和质膜保持完整，脂质过氧化的发生率显著降低。随后S. K. Baishya等[4]在另一篇文章中指出，用含胆固醇的甲基-β-环糊精进行预冷冻处理，也可提高冷冻保存猪精液的质量。猪精子由于精子膜中不饱和脂肪酸含量多，对氧化应激特别敏感，某些猪精浆抗氧化剂会积极参与公猪精子耐冷耐受性，使低温处理引起的氧化应激最小化。

白藜芦醇（resveratrol，Res）主要来自葡萄和毛叶藜芦。它是一种天然抗氧化剂，一种植物防御素，对植物起保护作用，在植物遇到过量紫外线照射、真菌感染等不适宜条件下产生[5]。Res作为一种天然的非黄酮类多酚物质，近年来一直是科学研究的焦点，因为人们认为它对人类健康有积极影响[6]。Res的化学式为C12H14O3，分子量为 228.25，具有抗氧化、抗癌、降糖和抗衰老的活性[7]。Res的细胞防御机制是通过直接中和ROS或间接增强抗氧化酶的表达来抑制低密度脂蛋白（LDL）氧化维持细胞氧化还原平衡[8]。抗氧化剂Res对精子发生有保护作用[9]。C. R. Lv 等[10]研究表明补充10 μM或50 μM浓度的Res可以改善解冻后山羊精子的质量，这可能是抑制ROS的产生所引起的。N. Abouzar等[11]研究表明添加40 μM白藜芦醇的改良BTS（beltsville thawing solutjon）扩展剂可提高鸡精子解冻质量。说明Res在精液冷冻保存中具有实用性。为了评价Res对猪冻融精子质量的影响，该研究将不同浓度的Res添加到冷冻基础液中，对冻融精子的质量进行评价，以期为建立高效猪精液冷冻技术体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜猪精液来源于吉林省农业科学院畜牧科学分院原种猪场的松辽黑猪。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

BTS溶液：二水柠檬酸三钠1.25 g，乙二胺四乙酸1.25 g，碳酸氢钠1.25 g，青霉素钠0.60 g，氯化钾0.75 g，葡萄糖37.00 g，硫酸链霉素1.00 g在1 000 mL三蒸水中溶解， pH调节为7.2～ 7.4，渗透压310 mOsm/L，4 ℃保存。

冷冻基础液Ⅰ：乳糖35 g，葡萄糖25 g，青霉素钠0.60 g，碳酸氢钠1.25 g，硫酸链霉素1.00 g，卵黄200 mL溶于800 mL三蒸水中，调节pH为7.2～7.4，渗透压317 mOsm/L，4 ℃保存。

冷冻基础液Ⅱ：添加OEP和甘油，在冷冻基础液Ⅰ的基础上使OEP终浓度为0.50%（v/v），甘油终浓度为3.00%（v/v）。

果糖-柠檬酸钠低渗溶液：二水柠檬酸钠7.35 g，果糖13.51 g在1 000 mL三蒸水中溶解，渗透压150 mOsm/L，4 ℃保存。

吖啶橙（acridine orange，AO）染液：AO 0.010 g，柠檬酸0.764 g，磷酸氢二钠0.806 g溶于57.500 mL三蒸水中，现配现用。

2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’,7’-dichloro dihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）染液：DCFH-DA 0.50 g，用DMSO 102.61 mL溶解，分装，避免反复冻存。

1.2.2 采集精液

采用手握采精法，佩戴灭菌手套，右手握公猪阴茎模仿母猪对公猪的刺激以诱导射精，左手拿着采精杯，杯子上覆盖着精液过滤膜，舍弃开始的稀精部分，收集浓精部分。

1.2.3 精液冷冻

采集的精液用保温箱装好，于2 h之内送到实验室。首先通过嗅觉和眼观检查，选择带腥味、乳白色的精液进行镜检，选择活力在90%上，密度介于2.0亿～4.0 亿/mL的精液进行冻存前处理。

合格的精液等温等体积加入BTS溶液稀释，置于25 ℃恒温箱1 h，期间不定时混匀精液，然后放入17 ℃恒温箱平衡2 h，期间不定时混匀。平衡后的精液等体积分为5份，2 400 r/min，17 ℃下离心10 min，弃上清，沉淀备用，冷冻基础液Ⅰ17 ℃预冷。然后分别加入沉淀中（0、25 μM、50 μM、100 μM、200 μM的Res分别加入冷冻基础液Ⅰ中），重悬后4 ℃恒温箱中平衡3 h。随后加入等体积的冷冻基础液Ⅱ，使精子终浓度为5×108个/mL，混匀后灌装于0.5 mL细管中，封口。液氮熏蒸（上方3 cm处），熏蒸10 min，然后放入液氮中。在液氮罐中储存1个月后检测精液质量。

1.2.4 精液解冻

从液氮罐中取出待测样品，50 ℃水浴锅中孵育16 s（细管离开液氮不能超过8 s），转移至37 ℃预热的1.5 mL离心管中待检，精液解冻后进行以下检测。

1）精子活力检测

活力通过计算机辅助精子分析系统（CASA）检测。

2）精子质膜完整性检测

使用精子低渗透膨胀试验（HOST）来检验精子的质膜完整性。果糖-柠檬酸钠低渗溶液提前37 ℃预热，精液解冻，然后与果糖-柠檬酸钠低渗溶液混合，溶液的添加量使精液终浓度为5×106个/mL，放在37 ℃水浴锅中15 min，涂片镜检，尾部卷曲的是质膜完整的精子，尾部不卷曲的精子是质膜受损的精子，本试验每次至少计数200个精子，重复5次以上。

3）精子顶体完整性检测

使用异硫氰荧光素标记的花生凝集素（fl uorescein isothiocyanate peanut agglutinin，FITC-PNA）荧光染色法检测。解冻后的精液中加入1 mL于37 ℃预热好的PBS，使用控温离心机2 400 r/min离心5 min，留下沉淀，在其中加入PBS重悬，反复3次。最后1次用PBS调整精液浓度，使精子密度保持在5×106个/mL左右，混匀，取30 μL均匀涂在载玻片上，自然晾干后用甲醇均匀涂片，室温下固定10 min，然后在黑暗环境下取30 μL FITC-PNA染液均匀涂在载玻片上，把载玻片放到湿暗盒中，湿暗盒放到37 ℃恒温箱中，30 min以后取出，PBS缓慢冲洗，黑暗环境下自然晾干。200×荧光显微镜下每次计数精子不少于200个，每组试验重复5次以上，注意激发光波长在480 nm，发射光波长在530 nm。

4）精子DNA完整性检测

使用AO荧光染色法检测精子的DNA完整性。精子的前期处理同上，精液解冻，然后用PBS洗3遍，使精子浓度保持在5×106个/mL左右，取30 μL均匀涂在载玻片上，自然晾干后用无水乙醇-冰醋酸（3∶1）固定3 h，放入黑暗环境下新配的AO染液中10 min，PBS缓慢冲洗，黑暗中自然晾干后加石蜡油封片。200×荧光显微镜下每次计数精子不少于200个，每组试验重复5次以上，激发光波长在480 nm，发射光波长在530 nm。

5）线粒体活性检测

使用碘化丙啶（PI）和罗丹明123（rhodamine 123，Rh123）共同染色判定。精子前处理同顶体完整性检测。准备100 μL PBS提前于37 ℃预热，后续操作均在黑暗环境下进行，在 PBS 中添加 1 μL PI和 1 μL Rh123，温育10 min，随后加入50 μL提前处理好的精液样品，37 ℃水浴锅中温育30 min。取温育好的样品滴在载玻片上，盖好盖玻片，镜检，200×荧光显微镜下每次计数精子不少于200个，每组试验重复5次以上，激发光波长在488 nm，发射光波长在513 nm。

6） ROS水平检测

使用DCFH-DA荧光染色法判定。精子前处理同顶体完整性检测，离心去上清后使用DCFH-DA染液（10 μM，DMSO溶解）重悬，使精子浓度保持在5×106个/mL左右。精液样品放入37 ℃水浴锅中避光温育30 min，用预热后的PBS缓冲液洗3次，200×荧光显微镜下每次计数精子不少于200个，每组试验重复3次以上，激发光波长在504 nm，发射光波长在529 nm。

7）抗氧化酶活性、MDA水平检测

CAT、SOD、GSH-Px的检测和MDA水平的检测使用试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，进行试验时严格按照试剂盒说明操作，每项检测重复3遍以上。

1.3 数据分析

本试验所有数据用SPSS 21.0统计软件ANOVA分析。本试验所有数据采用平均值±标准差表示，P＜0.05为差异显著。采用软件Image J分析ROS水平。

2 结果

2.1 添加Res对解冻后精子质量的影响

与对照组相比，在冷冻基础液中添加 25 μM、50 μM Res均可显著提高解冻后猪精子活力（P＜0.05）。当添加100 μM Res时，与50μM组相比显著下降（P＜0.05）。当200 μM的Res添加浓度与各添加组相比，精子活力显著下降，且显著低于对照组（P＜0.05）。其中添加50 μM 组活力最高（图1）。

与对照组相比，50 μM Res添加到冷冻基础液中可以显著提高解冻后猪精子质膜完整率（P＜0.05），添加200 μM Res可以显著降低解冻后猪精子质膜完整率（P＜ 0.05），添加 25 μM、100 μM Res均可提高解冻后猪精子质膜完整率，但差异不显著（P＞0.05）（图2）。

与对照组相比，在冷冻基础液中添加50 μM Res可以显著提高解冻后猪精子顶体完整率（P＜0.05），添加25 μM、100 μM Res均可提高解冻后猪精子顶体完整率但差异不显著（P＞0.05），添加200 μM Res可以降低解冻后猪精子顶体完整率但差异不显著（P＞0.05（）图3）。

与对照组相比，在冷冻基础液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可提高解冻后猪精子DNA完整率，但差异不显著（P＞0.05）。当Res添加浓度为100 μM时，DNA完整率最高。当Res添加浓度为200 μM时，DNA完整率降低，但差异不显著（P＞0.05）（图4）。

与对照组相比，在冷冻基础液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可显著提高解冻后猪精子线粒体活率（P＜0.05），其中50 μM添加组线粒体活率最高，添加200 μM Res可以降低解冻后猪精子线粒体活率，但差异不显著（P＞0.05）（图5）。

2.2 添加Res对解冻后精子抗氧化酶、ROS水平、MDA水平的影响

与对照组相比，在冷冻基础液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可显著降低解冻后猪精子ROS水平（P＜0.05），当浓度为50 μM时，ROS水平最低（图6）。

与对照组相比，在冷冻基础液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可显著提高解冻后猪精子CAT活性（P＜0.05），其中Res添加浓度为50 μM时，CAT活性最高（图7）。

与对照组相比，在冷冻基础液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可显著提高解冻后猪精子SOD活性（P＜0.05），其中Res添加浓度为50 μM时，SOD活性最高（图8）。

与对照组相比，在冷冻基础液中添加 25 μM、50 μM、100 μM Res可以显著提高解冻后猪精子GSH-Px活性（P＜0.05），其中Res添加浓度为50 μM时，GSHPx活性最高。当Res添加浓度为200 μM时，GSH-Px活性下降，但差异不显著（P＞0.05）（图9）。

与对照组相比，在冷冻基础液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可显著降低解冻后猪精子MDA水平（P＜0.05），其中Res添加浓度为50 μM时，MDA水平最低。当Res添加浓度在200 μM时，MDA水平升高，但差异不显著（P＞0.05）（图10）。

3 讨论

Res是可以从虎杖、葡萄等植物中得到的天然非黄酮类多酚抗氧化物质。Res分子中含有酚羟基，可以电离出H+，具有较强的还原性，可以还原氧自由基，减少氧自由基的积累[12]。刘程[13]在研究中发现添加Res可以改善解冻后牛精液的质量参数，包括活率、顶体完整率、质膜完整率、总抗氧化能力、丙二醛水平、GSH-Px活性。Z. D. Zhu等[14]研究发现添加 50 μM Res，能显著提高解冻后猪精子的运动能力、膜完整率、顶体完整率、线粒体活率、GSH-Px活性、SOD活性、CAT活性等，可以降低解冻后精子的脂质过氧化、ROS水平和凋亡率。证明Res可通过促进5’-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶磷酸化，会导致精子ROS产生水平的降低，抗氧化防御系统在精子中被改善，精子受ROS的影响降低，损伤减小。该研究中发现添加50 μM Res可以显著改善精液品质，与Z. D. Zhu等人的研究结果一致。说明Res可以有效的应用于猪精液冷冻保存。

精子在冷冻过程中会产生大量的ROS，这些氧自由基会攻击精子膜、线粒体膜，DNA等，膜损伤导致信号传递、物质交流等功能受损，DNA片段化导致遗传信息传递障碍，最终导致凋亡。这些因素使得解冻后的精子品质大大降低[15]。Res作为天然抗氧化剂可以减少ROS的积累，通过清除体内氧自由基，脂质过氧化反应会由此减弱，精子在冷冻过程中因氧化应激而受到的损伤也会由此降低，最终精子品质得到提升。

该研究将天然抗氧化剂Res应用于猪的冷冻精液中，取得较好的效果，说明其可以在冻精实际生产中加以考虑，但是它们对精子保护的多效性机制有待于进一步的研究。