猪冷冻精液的生产及应用

涂 枫，王 丽，方晓敏，付言峰，任守文

（江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014；农业农村部种养结合重点实验室，江苏 南京 210014）

精液冷冻保存技术指利用干冰、液氮、液氦等制冷剂作为冷源，将新鲜精液离心浓缩后用保护剂稀释和降温平衡，最后冷冻保存。冷冻精液可以使精子的绝大部分活动暂停，待解冻复苏后恢复精子的受精能力，使精液可以达到长期保存和远距离运输的目的[1]。猪精液冷冻保存技术可以提高优良种公猪的利用率，也可用来保护我国地方猪种的遗传资源，但猪冷冻精液与其他家畜相比，其冷冻后的精子活力低且成本高。而作为多胎家畜，精子活力、精子质膜及顶体的完整性、受胎率和窝产仔数是评价猪冷冻精液效果的主要指标[2]。影响猪精液冷冻效果的因素很多，如公猪品种及个体的差异、稀释液成分与稀释比例、添加剂、pH、降温程序、平衡时间和解冻方式等，猪冷冻精液生产仍存在诸多待优化改进的环节。文章以细管冷冻为例对猪冷冻精液生产、应用及前景做综合性阐述，以期为猪场实际生产提供借鉴。

1 猪冷冻精液的制作及保存

猪冷冻精液的制作主要有粒状、细管、袋装和安瓿瓶四种形式，各形式冷冻精液对母猪的分娩率和窝产仔数无显著差异，其中以细管猪冷冻精液最常用，解冻方法便捷，且0.25 mL和0.5 mL细管制作的冷冻精液，解冻后的精子活力显著高于5 mL细管冷冻效果，目前在养猪业应用广泛[2]。

猪冷冻精液生产包括精液采集、精液预处理、精液稀释及冷冻保存等环节。目前并没有统一的精液冷冻程序，生产中以改进后的Westendorf设计法应用较多。

1.1 精液采集

猪原精液质量直接影响受精的效果，经过冷冻后精子会受到损伤，进一步影响冷冻精液的受精效果。精液品质评定的最终标准是实际受胎率、分娩率、产仔数等，但这些指标测定耗时长，实际生产中会使用光学显微镜进行常规的精子评价指标检测，包括精子密度、数量、畸形率、活率等。因此，为保证猪冷冻精液的使用效果，新鲜的精液被采集后需进行精液品质评定，选取精子活率大于0.7，精子畸形率小于18%，密度达到3.0×109spz/mL（每毫升含30亿个精子）的精液进行细管冷冻精液的制作[2]。

1.2 精液预处理

新鲜精液室温采集后用BTS稀释液按比例等温稀释，然后置于15～17 ℃恒温冰箱平衡1～4 h，据需运输时间和气温而定，运输时间越长，气温温度越高，平衡时间越长。运输时间尽量避免过长，建议一般不要超过2 h，同时应避免光照和剧烈震动。

猪的精子对温度敏感，且精液量较大，猪精液采集后精子活力会迅速下降，冷冻前除去大部分精浆可以减少精子的死亡率[3]，可在15～17 ℃条件下，以离心力800 g离心8～10 min后去除部分上清。

1.3 精液的稀释

精液中的精子在冷冻过程中会产生严重的损伤，存在渗透压发生变化、细胞内冰晶的形成以及冷冻过程中水分通过细胞膜时对膜的影响等[4-6]。在精液冷冻过程中，可通过在稀释液中添加蛋白或脂蛋白如卵黄、牛乳和酪蛋白提高精子的抗冷休克能力，并添加柠檬酸钠、EDTA和Tris等降低脂类的过氧化物反应，从而维持精子在体外保存的存活率[7]。在此基础之上添加其他成分，如咖啡因、氨基多糖类、己酮可可碱、生殖激素和维生素等，稀释液的种类丰富，功能各有不同，但都会在不同程上度提高精子冷冻后的品质[8-11]。

精液的稀释主要是一次和二次稀释法，一次稀释法是使精子不经过适应阶段就与甘油接触，这样会对精子顶体造成损伤；为了减轻对精子的损伤，一般采用二次稀释法进行精液稀释。精液的稀释应该按照比例进行，精液稀释倍数过小，精子密度偏大，那么平均下来贮存过程中供给精子的养分偏少；而稀释倍数过大，则使用时有效精子数量和精子活力降低，会影响母猪繁殖性能[12]。

将预处理的精液在15～17 ℃平衡后，在等温条件下加入一定比例不含甘油的冷冻稀释液I，使温度缓慢降至 4～5 ℃，一般速度为90～120 ℃/min，平衡2 h左右，再加入含有甘油的冷冻稀释液Ⅱ，甘油的终浓度在2%～4%的冷冻效果最好，一般为3%[13]。

1.4 猪冷冻精液的保存

猪精液冷冻处理过程对精液品质影响极大，其中，猪精液的冷冻速率对精子可以安全通过-60～0 ℃的低温区域，以及保障解冻后的精子活力至关重要。猪精液冷冻保存的冷源材料主要有干冰、液氮和液氦，目前最常用的是液氮[14]。用冷冻液稀释处理后的精液分装到细管中，用聚乙烯粉快速封闭管口，再将细管置于冷冻支架上，于0～4 ℃平衡1 min后，置于装有液氮的带盖器皿中约20 min，使细管精液彻底冷冻后，移入液氮罐中保存。

2 猪冷冻精液的解冻及使用

2.1 精液解冻及精子活力评定

冷冻精液在解冻过程中，会经过冰晶化的温度区域，合适的解冻程序可以减轻精子在此时的受损程度。一般合适的解冻温度为35～40 ℃或50～70 ℃，根据细管容量的大小，设置不同的解冻温度和时间，如研究表明，0.25 mL细管的冷冻精液经70 ℃水浴8 s或39 ℃水浴30 s效果较好[15]；0.5 mL细管的冷冻精液经37 ℃水浴30 s或者57 ℃水浴10 s或者62 ℃水浴5 s效果较好[16]；而5 mL细管的冷冻精液经52 ℃水浴35 s效果较好[17]。

解冻后精液品质的评价指标主要是精子活率和活力，将细管冷冻精液解冻后，剪开细管的收尾，挤出1～2滴进行显微镜镜检，观察精子以直线运动的百分数，等级评定在0.3以上的予以使用[18]。此外，若需要全面地评价精子的质量，可以检测多项指标，包括精子密度、pH、质膜完整性、顶体完整性、精子获能状态、精子畸形率、精子存活时间、精子线粒体功能、精子与透明带的结合能力、卵母细胞穿透能力和体外受精能力等[19]。

2.2 人工授精

猪冷冻精液采取子宫角深部输精效果较好。普通的授精方法只是将输精管送到子宫颈，而子宫角深部输精则是先利用普通输精的方式将输精管大头插入到母猪子宫颈，再将输精管内部小管缓慢深入子宫内部，然后连接输精瓶进行输精。子宫角深部输精可以将输精管送到子宫内部使精液直接进入子宫内，精子需要游动的距离更短，可以提高冷冻精液的利用效率和受精效果，成为更加合适的输精方法[20,21]。为了保证授精效果，可在母猪发情期进行多次输精，每头母猪每次使用10支左右0.5 mL细管的冷冻精液，将冷冻精液与等温平衡的稀释液混合后进行深部输精[22]。

3 猪冷冻精液的应用现状及前景

现阶段猪冷冻精液的应用主要是种质资源的保护及利用，使优秀遗传资源克服时空的限制；利用冷冻精液取代活体引种，降低运输、管理等成本，生物安全性高，便于疫情疾病的防控；加快模式动物胚胎相关研究的进展。

我国地方猪种因肉质佳、产仔数高及抗逆性好，为世界养猪业做出了重要贡献。为加强畜禽遗传资源保护和利用，促进现代畜牧业健康可持续的发展，农业农村部制定了关于地方猪种遗传资源保存方案，利用冷冻精液保种技术已收集到25万份冷冻精液，特别是在疫情防控阶段，冷冻精液技术的应用加快了地方猪种质资源的保存和利用[23,24]。

我国在非洲猪瘟防控阶段推行跨省禁运和省内堵卡点设置，使本就受限制的活体引种更加困难，猪场通常采取不引种的自繁自养策略，不仅降低了猪群的整体质量，还会造成种猪场生产规模的缩减，严重限制养猪业的发展[25]。冷冻精液的使用可以缓解猪场引种困难的问题，且冷冻精液生产过程中，进行精清分离的同时可将精液中的病毒去除，精液冷冻后可存放的时间增长，便于在病毒潜伏期给予公猪更长时间的健康状态观察。常温精液保存时间一般不超过7 d，而非洲猪瘟病毒的潜伏期可达21 d甚至更久[26]。因此，在疫病防控情况下，冷冻精液较常温精液成为更合适的引种和保种方式。

随着猪人工授精技术的提高和繁殖新技术的运用，冷冻精液的受胎率得到提升。猪作为人类疾病研究的模式动物，与猪胚胎相关的科学研究得到了迅速地发展，猪早期胚胎主要是通过新鲜精液或冷冻精液进行体外受精获得。冷冻精液较新鲜精液运输更方便，但其体外受精率较低。随着单精注射技术的成熟，卵母细胞质注射冷冻后精子得到的总囊胚率较新鲜精液体外受精率高[27]，冷冻精液在科研上的使用将会得到进一步扩展。