球等鞭金藻对氟苯尼考胁迫的响应研究

张莺脐 张羡宇 石 硕 刘佩武 张 倩 刘 鹰 郭 睿

(1. 大连海洋大学海洋科技与环境学院，大连 116023; 2. 设施渔业教育部重点实验室，大连海洋大学，大连 116023)

氟苯尼考(Florfenicol, FFC)是近些年来水产养殖业中使用最为广泛的抗生素药物之一, 因其可用于治疗多种鱼类的细菌性疾病, 如肠败血症、脊柱病、疖病和链球菌败血症等[1], 且具有抗菌活性高、无潜在致再生障碍性贫血等优点,作为氯霉素禁用后的主要替代药物, 在水产养殖中发挥着重要作用[2]。据调查, 2013年我国抗菌药物的总用量高达8.4×107kg, 其中氟苯尼考使用量将近1×107kg,列居所有兽用抗菌药物用量的前列[3]。Zong等[4]在2007年对大连养殖场周边海域的调查研究中发现,氟苯尼考残留量达34.9—11000 μg/L。氟苯尼考理化性质稳定, 在生物体内不能被完全代谢[5], 经污水处理厂处理也不能被完全降解[3,6], 残留的抗生素经多种途径不断的被汇入到水环境介质中, 造成了抗生素及抗生素降解物“假持久性”存在的现象[7],使得非靶标水生生物遭到长期慢性暴露。有研究表明, 水产养殖中常用的四种抗菌药(多拉菌素、甲硝唑、氟苯尼考、土霉素)对水生态系统中的非靶标生物, 如海洋费氏弧菌(Vibrio fischer)、斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、浮萍(Lemna minor)及水蚤(Daphnia)等均具有显著的毒性作用[8]。

海洋微藻是海洋水生生态系统中的初级生产者, 可以通过光合作用为水体中软体动物、甲壳动物和鱼类等水生生物提供氧气和食物, 其种类的多样性及初级生产量直接影响整个水生系统的结构和功能[9,10]。球等鞭金藻(Isochrysis galbana)具有无细胞壁、体积小、繁殖快、营养丰富, 以及易被贝类幼虫捕捉和消化吸收等特点, 常被用作海洋经济双壳类动物幼虫优良的开口饵料[11]。此外, 球等鞭金藻细胞内富含多糖及多种重要的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)[12], 是类胡萝卜素等活性物质的潜在来源[13], 也可作为化石燃料的生物替代品。同时, 球等鞭金藻易于培养,是进行水生生态毒理学研究的理想模式生物。

为探究水环境中抗生素残留对非靶标生物的影响, 本文以球等鞭金藻为实验对象, 研究环境相关浓度水平的氟苯尼考对球等鞭金藻生长和光合作用的影响, 并通过比较细胞内类胡萝卜素和脂肪酸含量的变化探究氟苯尼考对球等鞭金藻细胞的急性毒性作用机理。本研究将探究对水产养殖环境中抗生素残留的生态风险, 以期为水产养殖过程中抗生素的科学合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

球等鞭金藻藻种来自大连玉洋集团, 经扩增培养后作为试验材料。氟苯尼考粉(纯度为≥98%, 山东亚康药业有限公司), 氟苯尼考标准品(CAS 73231-34-2, 纯度≥99%)和乙酸铵(NH4Ac)购自Sigma-Aldrich, 色谱级甲醇和乙腈购自禹王集团。玻璃纤维过滤膜(GF/F, 47 mm)、固相萃取柱(Oasis MAX, 1 cc, 30 mg)购自Waters。实验过程中所用器具在使用前, 于121℃灭菌锅中高温灭菌。

1.2 藻类培养及生长抑制

使用100 mL f/2培养基于锥形瓶中培养球等鞭金藻, f/2培养基主要包括: NaNO3、NaH2PO4、微量元素(ZnSO4·4H2O、MnCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeC6H5O7·5H2O、Na2MoO4和Na2EDTA,纯水配置)和维生素溶液[VB1、VB12和VH(生物素)]。培养基与灭菌海水按1﹕1000比例添加配置。

球等鞭金藻接种于150 mL锥形瓶, 培养体积为100 mL, 瓶口使用无菌透气封口膜以防污染, 置于25℃光照培养箱中培养, 培养周期72h, 光照强度6500 lx, 光暗比12L﹕12D, 每天定时摇瓶3次。每天取出3 mL藻液, 使用分光光度计(GENESYS 10S,Thermo)于680 nm处检测各实验组培养液光密度,并以培养基作为参比确定藻液密度。利用血细胞计数板计数藻细胞生物量, 绘制生物量-光密度标准曲线(Y=14162X–0.0783,R2=0.999), 藻细胞生物量与光密度之间具有较好的相关性。实验选取的氟苯尼考暴露浓度为0、0.001、0.01、0.1、1.0、10、20和50 mg/L, 其中包括已在养殖尾水中检测到的残留浓度(0.001 mg/L)[13], 及实际养殖过程中投喂浓度(10 mg/L), 每组设置三个平行。根据OD680计算抑制藻细胞生长的EC50值(半最大效应浓度)。

1.3 细胞内氟苯尼考含量的检测

细胞中氟苯尼考浓度的检测方法参照Song等[5]的研究, 使用高效液相色谱仪(HPLC, SPD-20A, 岛津)检测球等鞭金藻细胞内氟苯尼考的含量。

前处理方法: 利用玻璃纤维滤膜收集50 mL经氟苯尼考暴露72h的藻液(106cells/mL), 使用培养基冲洗滤膜后, 将滤膜置于15 mL离心管中, 加入5 mL色谱级甲醇, 涡旋2min, 超声30min后, 利用细胞超声破碎仪(800 w, 5min)进行细胞破碎。经4500 r/min离心10min, 收集上清液。重复上述步骤, 合并上清液。将上清液置于温和的氮气流下, 于40℃下浓缩液体至1 mL, 加入超纯水至5 mL, 使用固相萃取柱进一步对样品进行浓缩纯化。固相萃取柱事先由4 mL 0.1%氨水甲醇、4 mL甲醇和4 mL超纯水进行活化后过样, 之后加入4 mL钼酸铵(25 mmol/L,pH 4, 色谱级)进行淋洗, 使用1 mL甲醇和1 mL 0.1%氨水甲醇洗脱。取1 mL样品装入样品瓶, 上机待测。甲醇和水、乙腈和水是检测氟苯尼考时最为常用的流动相组合[14,15], 通过对流动相及流动相比例的改变, 发现当流动相为甲醇﹕水(v﹕v)=50﹕50时, 峰型较好, 适用于检测球等鞭金藻细胞内氟苯尼考的浓度。

检测条件: 流动相为甲醇﹕水= 50﹕50(v﹕v), 液相色谱柱采用Thermo Hypersil GOLD色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 柱温40℃, 检测波长为223 nm, 进样流速为1 mL/min, 进样量为20 μL。

标准曲线绘制: 称取氟苯尼考标准品0.0010 g,使用甲醇(色谱级)溶解并定容至100 mL, 配制标准储备液浓度为10 mg/L, 于–4℃冰箱中保存备用。上机检测前使用甲醇稀释成浓度为0.01、0.1、1、5、10 mg/L的标准溶液。HPLC检测程序同上, 以峰面积为纵坐标, 氟苯尼考浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 并计算回归方程及相关系数。

1.4 光合色素含量的测定

球等鞭金藻细胞中光合色素浓度的检测方法参照Xiong等[16]的研究。不同浓度氟苯尼考暴露72h后, 收集10 mL藻液, 通过离心去上清(4500×g,10min, 4℃)获得藻细胞团, 用于检测藻细胞中叶绿素和类胡萝卜素的含量。使用饱和碳酸镁配置的90%丙酮溶液重悬细胞团, 以消除叶绿素酶干扰。在60℃黑暗条件下孵育30min后, 再次离心(4500×g,10min, 4℃)。取上清液于分光光度计在波长为665、652及470 nm处检测吸光值, 并根据以下公式对光合色素的浓度进行计算:

1.5 脂肪酸含量检测

藻粉的制备: 离心(4500 r/min, 5min)100 mL氟苯尼考暴露72h的藻液, 收集细胞团, 加入20 mL预冷的0.5 mol/L碳酸氢氨溶液去除藻细胞表面盐分。再次离心(4500 r/min, 10min, 4℃)去上清, 收集藻细胞。使用冷冻干燥机(SCIENTZ-10N, 新芝)冷冻干燥24h, 恢复至室温后, 使用玛瑙研钵研磨, 制备藻粉。–20℃密封保存, 待用。

样品前处理: 称取藻粉4 mg, 加入30 μL十七烷酸甘油三酯(Glyceryl triheptadecanoate, CAS 2438-40-6, 3.04 mg/mL, Sigma), 加入5 mL 2%硫酸甲醇进行预处理。将样品置于磁力搅拌器上, 在600 r/min、70℃下进行1h油浴, 对样品进行甲酯化[17]。静置, 待恢复至室温, 加入0.75 mL超纯水, 2 mL正己烷, 涡旋混匀后, 将样品倒入装有适量无水硫酸钠的离心管中, 4500 r/min离心2min去除水分, 将上层有机相转入1.5 mL进样瓶, 上机检测。

检测条件: 使用气相色谱仪(7890A GC System,Agilent Technologies, USA)对藻细胞内脂肪酸含量进行检测。初始温度为210℃, 进样口的温度为250℃, 检测器的温度为280℃。载气为高纯度N2和H2, 流速分别为20 和30 mL/min, 空气流速为400 mL/min。自动进样针清洗剂为正己烷, 进样前后各清洗3次, 进样量为1 μL。通过与标准脂肪酸保留时间进行对比, 鉴别各脂肪酸组分, 以面积归一化法计算各脂肪酸组分的相对百分含量[18]。

1.6 数据统计

用SPSS18.0 统计软件和Origin Pro软件对测定结果进行统计分析, 实验数据以平均值±标准误(Mean±SE)表示。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行分析, 事后检验采用Duncan方法或Dunnett’s C test对各实验组与对照组间的数据进行比较。当P<0.05时, 被认为具有显著性差异, 当P<0.01时, 被认为具有极显著性差异。

2 结果

2.1 氟苯尼考对球等鞭金藻生长的影响

如图 1所示, 当氟苯尼考浓度低于1 mg/L时, 对球等鞭金藻细胞的生长有一定的促进作用, 当浓度为10—50 mg/L时, 氟苯尼考对球等鞭金藻的生长产生了显著的抑制作用, 且随着氟苯尼考浓度的增加和暴露时间的延长, 抑制作用也明显增加。20和50 mg/L氟苯尼考暴露组, 对球等鞭金藻存在显著抑制作用(P<0.05), 抑制率分别为53%和83%。通过研究发现, 各浓度组(除50 mg/L浓度组)在暴露24h时, 对球等鞭金藻产生的抑制作用无明显差异,随着暴露时间的增加, 对球等鞭金藻生长的抑制作用逐渐增大, 72h时10、20 mg/L浓度组与对照组相比具有显著的抑制作用(P<0.05)。

图 1 氟苯尼考暴露对球等鞭金藻生长的影响Fig. 1 The effects of florfenicol on the growth of Isochrysis galbana at the different exposure duration

采用Origin Pro软件非线性曲线拟合(NLFit)中的Growth/Sigmidal拟合工具对氟苯尼考暴露浓度和球等鞭金藻生长抑制率进行非线性拟合, 得到拟合模型的相关参数。拟合后效应曲线如图 2所示, 计算得出, 氟苯尼考对球等鞭金藻72h-EC50为17.12 mg/L。

2.2 球等鞭金藻细胞内氟苯尼考的积累

根据优化的前处理方法和液相色谱分析条件进行分析, 氟苯尼考保留时间为4.2min, 如图 3所示, 色谱峰与氟苯尼考浓度间具有良好的线性关系(Y=48844:2X¡4796:54R2=0.99), 根据线性公式计算球等鞭金藻细胞内氟苯尼考的蓄积浓度。实验结果发现, 在各浓度组暴露72h后, 藻细胞内氟苯尼考的积累量随着暴露浓度的增加而增加, 在低浓度氟苯尼考(0.001、0.01和0.1 mg/L)暴露下, 并未检测到细胞内氟苯尼考积累现象。在1、10、20、50 mg/L的氟苯尼考暴露72h后, 藻细胞内氟苯尼考积累浓度分别为5.2、11、65.4和122 μg/mL。

2.3 氟苯尼考对球等鞭金藻细胞内光合色素含量的影响

图 2 氟苯尼考对球等鞭金藻生长抑制率的影响Fig. 2 The effects of florfenicol on the growth inhibition ratio of Isochrysis galbana

图 3 球等鞭金藻中氟苯尼考的色谱图Fig. 3 The chromatogram map of florfenicol in Isochrysis galbana

根据氟苯尼考暴露对球等鞭金藻生长的结果,选择0、0.1、1、10和20 mg/L浓度作为后续试验浓度, 其中包括EC50-72h值, 保持其他培养条件不变。如图 4所示, 在氟苯尼考暴露72h后, 与对照组相比, 低浓度组(0.1、1 mg/L)中总叶绿素含量没有显著性差异, 10和20 mg/L浓度组总叶绿素含量分别显著降低19%和22.5%(P<0.01)。藻细胞内类胡萝卜素含量的变化趋势则与叶绿素含量变化趋势相反, 与对照组相比较, 1、10和20 mg/L暴露组细胞内类胡萝卜素浓度均出现较为明显的上升趋势,1 mg/L浓度组中细胞内类胡萝卜素含量极显著增加13%(P<0.01), 而10和20 mg/L 氟苯尼考暴露组显著增加26%和28%(P<0.05)。

2.4 氟苯尼考对球等鞭金藻细胞内脂肪酸含量的影响

图 4 氟苯尼考暴露对球等鞭金藻细胞内叶绿素和类胡萝卜素含量的影响Fig. 4 The effects of florfenicol on the chlorophyll and carotenoid of Isochrysis galbana

如表 1所示, 在试验条件下, 暴露浓度对球等鞭金藻细胞内脂肪酸组成及含量具有明显影响。在0.1和1 mg/L浓度组中藻细胞的总脂肪酸(Total Saturated Fatty Acids TFA)含量分别为(8.64±0.26)和(8.23±0.25) mg/mg, 与对照组相比呈显著下降趋势(P<0.05)。在10和20 mg/L浓度组中, 藻细胞脂肪酸含量分别为(9.23±0.53)和(9.46±0.21) mg/mg, 与对照组没有显著性差异。球等鞭金藻细胞内饱和脂肪酸(Saturated fatty acid SFA)及单不饱和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acid MUFA)含量均无明显的变化趋势, 仅在暴露浓度为1 mg/L时, 存在明显降低的现象。多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids PUFA)是一类长链的多不饱和脂肪酸, 主要包括α-亚麻酸(C18﹕3, LNA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)[19]。相对于对照组, 1、10和20 mg/L浓度组的藻细胞中PUFA含量有明显的增加趋势,而DHA、EPA含量无明显的变化。通过本研究发现, 在高浓度(20 mg/L)氟苯尼考的暴露下, 球等鞭金藻细胞内的多不饱和脂肪酸含量均出现较为明显增加的现象。

3 讨论

3.1 氟苯尼考暴露对球等鞭金藻生长的影响

目前, 环境中抗生素残留问题已经引起公众的广泛关注, 抗生素对微藻的急性毒性相关研究已取得了一定的进展, 但大部分研究集中于抗生素对淡水微藻的毒性作用的探究上[20—24], 而关于抗生素对于海水微藻的毒性作用机理的研究相对较少。氟苯尼考因其良好的药效学特征和相对较低的毒性而大量应用于鱼类细菌性疾病的治疗中[25]。然而,抗生素在环境中的残留会对非靶标生物产生不同程度的影响。Liu等[26]的研究发现, 氟苯尼考浓度低于2 mg/L时, 可促进中肋骨条藻(Skeletonema costatum)生长, 而浓度高于2 mg/L时, 氟苯尼考抑制其生长。然而, 在Ferreira等[27]的研究中发现, 土霉素和氟苯尼考对扁藻(Tetraselmis chuii)的抑制浓度分别为5.3和6 mg/L。本研究中, 50 mg/L浓度组在暴露24h时显示出显著的抑制现象, 随着暴露时间延长不存在恢复现象, 10和20 mg/L浓度组在暴露48h后开始出现抑制现象, 10 mg/L组对球等鞭金藻生长的抑制作用低于20 mg/L组。本研究结果与Lai等[28]研究结果相似, 当氟苯尼考浓度大于10 mg/L时对球等鞭金藻的生长具有一定的抑制作用。在低浓度的抗生素的作用下对藻类的生长起到一定的生长促进作用[29], 当氟苯尼考暴露浓度小于等于1 mg/L对球等鞭金藻的生长有一定的促进作用。环境中低浓度抗生素持久性存在的现象, 可能会引起水体中浮游植物的大量生长, 如东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、球形棕囊藻(Phaeocystis globosaScherffel)和尖刺拟菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens)等赤潮藻, 对生态环境产生一定的影响[30, 31]。

3.2 氟苯尼考暴露对球等鞭金藻细胞内光合色素合成的影响

光合作用是藻类重要的生理生化活动, 可将太阳能转化为化学能, 叶绿素在光合作用和光合反应中起着重要的作用[32]。在环境胁迫下, 叶绿素含量的降低会影响细胞内光合反应中心捕获光的能力,进而影响藻细胞内的光合活性。有研究表明[33], 水华微囊藻(Microcystis flos-aquae)在氟苯尼考和甲砜霉素(> 1 μg/L)暴露1—7d后, 其叶绿素荧光参数Fv/Fm结果与叶绿素a含量的变化趋势相似。本研究发现随着氟苯尼考暴露浓度的不断增加, 球等鞭金藻细胞内总叶绿素浓度呈下降趋势, 当暴露浓度达到10 mg/L时, 出现显著的抑制现象。造成该结果的原因可能有以下几种: (1)藻细胞出现应激反应[34];(2)藻细胞中积累过量活性氧(ROS)导致叶绿体结构被破坏, 进而影响叶绿素的合成[26]; (3)在抗生素的胁迫作用下, 导致藻细胞类囊体脂质过氧化, 影响电子链的传递, 进而影响藻类光合效率[35]。光合作用作为衡量藻类生长状态的主要指标[36], 通过比较本研究中藻类的生长与叶绿素含量的变化趋势,提示氟苯尼考暴露可能会抑制球等鞭金藻的光合效率, 影响叶绿素合成, 进而影响球等鞭金藻的生长。

在环境胁迫下, 藻细胞损伤主要是通过氧化压力形成的[37]。类胡萝卜是细胞内主要的光保护色素, 可吸收叶绿体中剩余能量, 避免产生激发态的单一氧分子, 避免膜体损伤, 从而起到光保护作用[38]。本研究发现, 随着氟苯尼考暴露浓度的增加, 球等鞭金藻细胞内的类胡萝卜素含量逐渐增加, 这与其他研究结果相一致[39,40]。类胡萝卜素根据其作用可分为初级类胡萝卜素和次级类胡萝卜素。初级类胡萝卜素为补充色素, 与光合作用密切相关。而次生胡萝卜素, 如虾青素等, 是由某些微藻在高胁迫状态时产生的, 不参与光合作用, 而是聚集在细胞脂质中, 抑制活性氧的生成, 进而保护叶绿体避免受损。此外, 类胡萝卜素色素有高抗氧化的特性,可以保护微藻免受自由基攻击, 稳定细胞代谢功能[41,42]。在低浓度氟苯尼考(<1 mg/L)的作用下, 球等鞭金藻细胞内的类胡萝卜素变化趋势不明显, 可能此时的类胡萝卜素主要为初级类胡萝卜素。而在高浓度氟苯尼考(>1 mg/L)的暴露下, 藻细胞受到抗生素的严重胁迫, 诱导藻细胞中次生胡萝卜素生成, 起保护作用。由于藻细胞在高浓度氟苯尼考(20 mg/L)的暴露下会积累大量的活性氧, 可能会对藻细胞光合系统产生应激性损伤, 进而破坏细胞代谢功能, 紊乱其生长[43]。

表 1 不同浓度氟苯尼考暴露对球等鞭金藻脂肪酸(FAME)组成的影响Tab. 1 The effect of florfenicol on the fame composition in I. galbana (%)

3.3 球等鞭金藻细胞内脂肪酸含量对氟苯尼考暴露的响应

球等鞭金藻具有独特的脂肪酸组成, 其富含营养价值较高的DHA和EPA, 是一种重要的水产养殖饵料生物[44]。有研究表明, 在虾幼体、海水鱼幼体及软体动物幼体时期投喂球等鞭金藻, 可显著提高水生物的生长和存活率[45]。通过本研究发现, 在氟苯尼考的暴露下, 球等鞭金藻细胞内DHA、EPA的含量无明显的变化现象。但在0.1和1 mg/L浓度下,藻细胞内总脂肪酸含量较对照组有明显下降的现象, 这可能与球等鞭金藻累积脂肪酸的特点有关,即生物量与总脂肪酸含量是呈极显著性负相关的[46],当生物量升高时, 总脂肪酸含量呈下降趋势, 此时细胞内的脂肪酸多用于细胞的生长分裂。暴露浓度高于1 mg/L时, 球等鞭金藻在抗生素的胁迫下,会将脂类作为首选的储能化合物, 脂肪酸含量增加从而帮助细胞抵抗外界胁迫, 减少细胞死亡[47]。

氟苯尼考对球等鞭金藻的72h-EC50值为17.12 mg/L, 依据国家环保保护局的新化学物质危害评估准则—生态毒理学危害分级标准[48], 确定氟苯尼考对球等鞭金藻的危害等级为中级, 经过72h的氟苯尼考暴露, 球等鞭金藻生长、光合色素、脂肪酸等生理指标均受到影响。这表明在水产养殖过程中抗生素的使用, 可能会对非靶标生物产生一定的危害作用。随着暴露浓度的增加, 抗生素在细胞内存在富集的现象, 这可能会导致水体中残留的抗生素随着食物链的传递而进入水生生物体内, 影响其生长发育。现有的研究多为抗生素对微藻类急性毒性实验, 鲜少有环境中残留的抗生素及其分解产物对水生动植物长期暴露的相关研究。因此, 有必要进一步探究环境中抗生素长期存在对水生生物的影响。

4 结论

本实验以球等鞭金藻为实验对象, 研究环境浓度氟苯尼考暴露72h后对球等鞭金藻生长的影响,探讨氟苯尼考对海洋微藻的作用机理, 得到以下结论: (1) 氟苯尼考在低浓度时(≤1 mg/L)可以促进球等鞭金藻的生长, 而在高浓度(1 mg/L)时, 对球等鞭金藻表现出明显的生长抑制作用, 氟苯尼考对球等鞭金藻72h-EC50值为17.12 mg/L, 符合中级毒性标准范围。(2)氟苯尼考暴露(10 mg/L)会显著降低球等鞭金藻的总叶绿素含量, 抑制叶绿素合成, 干扰球等鞭金藻正常的光合作用过程。(3)氟苯尼考暴露诱导球等鞭金藻细胞内类胡萝卜素和脂肪酸参与抵抗胁迫损伤。