不同碳氮比对生物絮团形成及对日本沼虾生长、抗氧化酶和消化酶的影响

2020-12-10傅洪拓孙盛明张文宜金舒博龚永生蒋速飞熊贻伟张禹宁

水生生物学报 2020年6期

金毅傅洪拓, 孙盛明乔慧张文宜金舒博龚永生蒋速飞熊贻伟钱珺张禹宁

(1. 南京农业大学无锡渔业学院, 无锡 214081; 2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,农业部淡水渔业与种质资源利用重点实验室, 无锡 214081)

随着我国水产养殖业的不断发展, 环境安全问题越来越严重, 不合理的排放和药物的滥用加剧了对环境的污染[1—2]。生物絮团技术不仅能降低养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐等无机氮含量[3], 还能促进养殖对象的生长[4], 提高饵料利用率和存活率[5—6]。碳氮比是指养殖水体中有机碳源和各种含氮物质质量的比值, 是影响生物絮团形成的重要因素。已有的研究表明, 水中的碳氮比达到15时就能产生絮团, 分泌胞外酶等活性物质, 促进异养微生物转化吸收养殖水体中的无机氮[7—9]。目前, 生物絮团技术已经在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[10—11]、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)[12]、斑节对虾(Penaeus monodon)[13]等虾类养殖中得到应用, 但是生物絮团技术在日本沼虾中的应用尚未见报道。

日本沼虾(俗称青虾)隶属长臂虾科(Palaemonidae), 沼虾属(Macrobrachium), 是我国重要的淡水养殖虾类之一, 因其肉质鲜美, 具有较高的经济价值。根据2018年中国渔业统计年鉴显示, 全国日本沼虾年产量超过2.7×108kg[14]。鉴于碳氮比是生物絮团形成的重要因素[15], 因此本研究以日本沼虾为研究对象, 研究不同碳氮比对生物絮团形成以及对日本沼虾生长、肠道消化酶和肝胰腺抗氧化酶活性的影响, 为日本沼虾的健康养殖提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验用虾和饲养管理

实验用虾取自大浦养殖基地(119°55′23″E,31°18′47″N)。先将日本沼虾暂养在室内的水缸中(30 cm×40 cm×100 cm, 120 L), 暂养1周稳定后, 将初始体重为(0.25±0.03) g健康且规格一致的日本沼虾放入水缸中, 每缸50尾。养殖周期50d, 每天投喂两次(9:00和15:00), 日投喂量为体重的5%—8%。对照组每天换水1/3, 实验组实行封闭式零换水养殖, 因采集水样和蒸发损失的水可以进行补充。养殖期间水温25—28℃, pH7.4—8.4, 溶氧大于6 mg/L。每天对日本沼虾的生长情况进行观察和记录。

1.2 碳源的选择与添加

以葡萄糖为碳源[16], 实验组按照不同碳氮比10(C/N10组)、15(C/N15组)、20(C/N组)和25(C/N25组)添加碳源, 对照组不添加碳源, 每组设置三个重复。按照Avnimelech[3]得出的生物絮团技术所需碳源计算公式根据确定各处理组添加葡萄糖的量分别是投喂饲料量的1/3、1/2、2/3和5/6。每次投喂1h以后, 取葡萄糖用养殖水充分溶解, 然后均匀泼洒。

1.3 样品收集与分析

样品收集在养殖过程中, 每7d取1次水样, 立即带回实验室用于氨氮和亚硝酸盐氮的测定; 在养殖实验结束后, 禁食24h后取样, 计数并称重, 每个缸取5只日本沼虾, 获取完整的肝胰腺和肠道, 用液氮速冻后, 于–80℃冰箱保存。

酶活测定在肝胰腺和肠道解冻后, 称取组织重量, 在冰浴条件下, 使用电动匀浆机匀浆, 按照1﹕9的比例把组织与生理盐水混合制成浓度为10%的组织匀浆液, 温度4℃, 转速3000 r/min, 离心10min, 取出上清液用于相关酶活指标的测定。淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、谷胱甘肽还过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)的测定均使用购自南京建成生物工程研究所的试剂盒, 酶活单位为酶量(U/mg)。

氨氮和亚硝酸氮的测定将水样过滤后, 采用纳氏试剂分光光度法测定水体中氨氮的浓度; 采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定水体中亚硝酸氮浓度。

生物絮团测定采集水样后均匀混合, 抽滤待测水样, 滤膜烘干称重测定总固体悬浮物(TSS)。另取1 L混合好的水样倒入英霍夫锥形瓶中直至刻度线, 然后静置30min, 待水样中悬浮物完全沉淀后, 观察沉淀物所在的刻度线, 此即为单位水体中生物絮团的体积[17], 记录絮团体积。取出含有生物絮团的水样在400倍显微镜下进行观察。

生长指标测定

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=(Wt–W0)/W0×100;

特定生长率(Specific growth rate,SGR, %/d)=(LnWt–LnW0)/t×100。

存活率(Survival rate,SR, %)=Nt/N0×100

式中,Wt和W0分别表示日本沼虾的终末平均重量和初始平均重量,t为养殖周期,N0和Nt分别表示日本沼虾的终末存活尾数和初始放养尾数, 重量单位为克(g)。

1.4 数据统计和结果分析

各个指标测出的数据用SPSS19.0进行分析, 先进行单因素方差分析(ANOVA), 如差异显著进行Duncan多重比较,P<0.5表示差异显著, 数据结果以平均值±标准误(Mean±SE)表示。

2 结果

2.1 不同碳氮比对各组氨氮和亚硝酸盐氮含量的影响

各组的氨氮和亚硝酸盐含量在前4周呈升高趋势, 在第4周达到高峰; 第4周以后对照组和C/N10组的氨氮和亚硝酸盐含量持续升高而C/N15组、C/N20组和C/N25组呈下降趋势(图 1), 并逐渐保持稳定。其中C/N20组的氨氮和亚硝酸盐含量在各个时期都保持在最低水平。

2.2 不同碳氮比对各组生物絮团形成的影响

在不同碳氮比条件下, 生成的生物絮团含量不同。养殖实验初期, 由于絮团产生还不稳定, 各组含量在第2周有略微下降; 第3周开始, 生物絮团产生的量明显上升, 随后的4周保持稳定, C/N20组的生物絮团含量最高(图 2)。

通过肉眼观察水体以及对比滤纸发现, C/N20组的养殖水体呈棕褐色, 且颜色最深, C/N20组抽滤出的固体悬浮物最多(图 3)。在400倍显微镜下观察生物絮团可发现丝状菌、小席藻、轮虫、舟形藻、有机物和微囊藻等组成成分(图 4)。

2.3 不同碳氮比对日本沼虾幼虾生长性能的影响

与对照组相比, C/N20组各项指标均是最高,C/N20组的末体重、增重率、特定生长率、存活率分别提高75.29%、88.86%、42.26%和36.68%(P<0.05, 表 1)。

2.4 不同碳氮比对日本沼虾肝胰腺抗氧化酶的影响

C/N20组的日本沼虾GPX活性为(37.10±1.36) U/mg与对照组和C/N10组差异显著 (P<0.05), 分别高出了43.19%和40.80%。C/N20组与C/N15组和C/N25组差异不显著(P>0.05, 图 5)。C/N20组SOD活性最高为(36.25±2.84) U/mg与对照组、C/N10、C/N15、C/N25组差异显著, 分别高出了73.35%、45.26%、28.17%和17.83% (P<0.05)。

图 2 各组生物絮团体积(A)和总固体悬浮物(B)变化趋势图Fig. 2 The biofloc volume and total solid suspended matter in different groups

图 3 显微镜下生物絮团形态图Fig. 3 Biofloc pattern under microscope (×400)

2.5 不同碳氮比对日本沼虾幼虾肠道消化酶的影响

C/N20组日本沼虾的淀粉酶活力最高为(1.56±0.02) U/mg, 与对照组、C/N10组、C/N15和C/N25组, 均有显著差异, 分别高了231.91%、239.13%、97.47%和132.84%(P<0.05, 图 6)。各组的脂肪酶活力相比均有显著差异, 其中C/N20组的脂肪酶活力最高, 比对照组、C/N10组、C/N15和C/N25组分别高了25.45%、50.47%、20.45%和1.90%(P<0.05)。C/N20组的胰蛋白酶活性最高, 分别比对照组、C/N10组、C/N15和C/N25组高了36.45%、20.77%、19.15%和9.49%(P<0.05)。

3 讨论

3.1 不同碳氮比对生物絮团形成和养殖水体的影响

生物絮团的形成主要靠水体中异养微生物的快速繁殖, 而微生物的生长繁殖最主要营养元素是碳和氮; 因此在本研究中, 按照不同碳氮比添加葡萄糖来培养生物絮团。由图 2可知, 在C/N 20组中,养殖水体颜色呈棕褐色, 生物絮团形成的效果最好,生物絮团体积和总固体悬浮物均高于其他处理组。有研究表明, 碳氮比不同, 生物絮团产生的时间、效果和作用机制也不一样, 因此维持适宜的碳氮比对生物絮团的产生至关重要。生物絮团可有效调节水质, 降低水体中三氮水平[18], 在实际生产中, 对水产经济动物造成伤害的主要是氨氮和亚硝酸盐, 在本研究中, C/N 15组和C/N 20组的氨氮和亚硝酸氮浓度显著低于对照组和其他处理组。邓吉朋等[13]的研究发现适宜的碳氮比能保证良好的水质, 但不同的是, 碳氮比越高水质越好。这与本研究中C/N 25组的结果有差异, 原因可能是物种和养殖过程上不同。

3.2 不同碳氮比形成的生物絮团对日本沼虾生长的影响

图 4 各组生物絮团总固体悬浮物Fig. 4 TSS of different groups

表 1 不同碳氮比对日本沼虾幼虾生长性能的影响Tab. 1 Effects of different carbon: nitrogen ratio on growth performance of Macrobrachium nipponense

图 5 不同碳氮比对日本沼虾幼虾肝胰腺GPX(A)、SOD(B)的影响Fig. 5 Effects of different C/N ratio on activity of antioxidant enzymes in hepatopancreas of Macrobrachium nipponense

生物絮团是一种富含多种营养成分的絮状物,其中含有35%—50%的粗蛋白和2.5%—9%的粗脂肪, 能量达到18—22 kJ/g[19], 能够作为虾类的潜在饵料。图 1证明了生物絮团含有多种组成成分, 包括轮虫和原生动物等, 其营养成分保证了日本沼虾的生长。刘杜鹃等[12]在罗氏沼虾(M. rosenbergii)育苗的实验中, 证明了向养殖水体中添加碳源, 提高碳氮比有利于罗氏沼虾仔虾的生长, 提高出苗率。李京昊等[20]应用生物絮团技术养殖克氏原螯虾(Procambarus clarkii), 碳氮比维持在15以上时,在减少投喂的情况下, 实验组克氏原螯虾的生长并没有受到影响, 而在本研究中, 碳氮比的升高对日本沼虾的生长有显著影响, 在碳氮比20时, 生物絮团含量最多且该组的日本沼虾的生长性能明显高于其余各组。这表明生物絮团对日本沼虾的生长起到了促进作用。这可能是因为产生的生物絮团含有的营养成分更易被日本沼虾消化吸收, 也有可能生物絮团中存在某些具有促进生长的活性物质[21]。

3.3 不同碳氮比形成的生物絮团对日本沼虾抗氧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶(SOD)在预防生物损伤, 减少自由基方面具有重要作用[22—23], 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶, 是评价抗过氧化能力的重要指标之一。在本研究中C/N20组日本沼虾的SOD显著高于其他组(P<0.5)。这表明该组的日本沼虾有更强的抗自由基能力, 保证了日本沼虾的健康生长。这与生物絮团在克氏原螯虾中的研究结果相似[20]。在本研究中, 从C/N15组开始, GPX有显著提高; 这与凡纳滨对虾(L. vannamei)的研究结果相似[24]; 但区别在于,凡纳滨对虾(L. vannamei)的GPX在碳氮比15时活性最高, 而日本沼虾的GPX在碳氮比20时活性最高,这或许是物种之间的差异造成的。也有报道认为,不仅是生物絮团中的微生物刺激了免疫机能的提升, 还有某些营养物质提高了机体的抗氧化水平,而碳氮比的高低影响了生物絮团的形成和其营养成分, 因此维持适宜的碳氮比对于提升养殖对象的抗氧化水平十分重要。在本研究中, 相比对照组,C/N20组的日本沼虾SOD和GPX的显著提高, 其具体作用机制还需进一步研究。

3.4 不同碳氮比形成的生物絮团对日本沼虾消化酶活性的影响

图 6 不同碳氮比对日本沼虾幼虾肠道淀粉酶(A)、脂肪酶(B)、胰蛋白酶(C)的影响Fig. 6 Effects of different C/N ratio on intestinal digestive enzyme activities of Macrobrachium nipponense

生物絮团能够提升水生动物的消化能力。淀粉酶能水解糖原和淀粉, 有利于养殖动物对糖类营养物质的吸收。在本研究中, C/N20组的淀粉酶活性显著高于其他组。这与Wang等[25]的研究结果相似。但葛海伦等[26]在罗氏沼虾的研究中发现, 生物絮团并没有提升罗氏沼虾肠道淀粉酶的活性。可能是因为培养生物絮团的碳源不一样, 导致絮团组成成分有所差异, 其发挥的作用也略有差别。脂肪酶能将甘油三脂水解, 促进肠道的吸收。在本研究中, C/N20组的脂肪酶显著高于其他组, 证明了碳氮比20时, 生物絮团能够显著提高日本沼虾肠道中的脂肪酶活性。徐武杰[24]的研究表明, 生物絮团显著了提高了凡纳滨对虾(L. vannamei)的脂肪酶活性,促进了凡纳滨对虾对脂肪的消化吸收。在克氏原螯虾[20]和罗氏沼虾[26]的研究中, 均证明了生物絮团能显著提升脂肪酶活性。胰蛋白酶是一种蛋白水解酶, 是评价虾类生长和营养状况的重要指标之一。在本研究中C/N20组的胰蛋白酶活性显著升高, 这与凡纳滨对虾[24]、罗氏沼虾[26]和克氏原螯虾[20]的研究结果一致。

观察发现, 日本沼虾有摄食生物絮团的现象,而已有的研究表明生物絮团确实含有淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶等消化酶[27,28], 故推测日本沼虾通过摄食生物絮团增加了肠道内的消化酶含量。消化酶含量的提高意味着机体消化能力和代谢水平的提高[29], 这有利于日本沼虾的生长发育。然而,在碳氮比较低时产生的生物絮团较少, 甚至没有生物絮团产生, 所以日本沼虾无法摄食足够的絮团提升消化水平。结合生物絮团形成规律并根据图 2比较各组水体颜色和固体悬浮物含量并可知, C/N20组的生物絮团含量最多, 这与各组消化酶活性的变化规律以及日本沼虾的生长规律相一致。因此, 适宜的碳氮比是形成絮团的重要条件, 也是促进日本沼虾生长和提高消化酶活性的重要因素。