马齿苋多糖对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用

黄小强,丁 辉,刘顺和,黄 涛,贾 安

(黄河科技学院医学院,河南郑州 450063)

肝脏是人体最重要的物质代谢器官和无法替代的免疫器官,易受到各种因素的损害,如毒素、药物和酒精都会造成肝脏损伤[1]。如果人体长期处于肝损伤就可能导致肝纤维化、肝癌及肝功能衰竭[2]。目前临床上多采用维生素类、核苷类及护肝类药物,虽然能够改善症状,但具有较大的局限性,并且副作用较大[3]。因此,寻找一种安全、有效的药物更为重要。近年来,中医药在治疗肝损伤研究方面取得巨大进步,众所周知,中药具有多靶点、多通路、安全有效等特点,在治疗肝损伤方面具有较大优势[4]。

马齿苋(PortulacaoleraceaL)为马齿苋科(Portulacaceae)一年生草本植物,又名长寿菜、五行草、马蜂菜等,其性寒,味酸,具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效[5],具有较高的药用和食用价值[6]。研究发现其化学成分主要为黄酮类、生物碱类、有机酚酸类、萜类、香豆素类等[7-9],现代药理研究发现,马齿苋具有抗炎、抗氧化、降血脂等功能[10-12],并在保肝方面具有突出的作用[13]。多糖是植物水提物中重要的化学成分,同时也是主要的活性物质,大量研究表明,植物多糖具有调节免疫、抗氧化、降血糖、调节血脂等作用[14]。但马齿苋多糖保肝作用研究鲜见报道。本研究通过CCl4诱导小鼠急性肝损伤小鼠模型,探讨马齿苋多糖对CCl4诱导小鼠肝损伤进行药理作用评价,并对其分子机制进行初步探讨,为马齿苋今后进一步深入开发和临床应用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

60只清洁级KM小鼠,体质量(20±2) g,雌雄各半 由黄河科技学院实验动物中心提供,实验动物生产许可证:SYXK(豫)2015-003；马齿苋 购自张仲景大药房；ELISA试剂盒:谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、A碱性磷酸脂酶(ALP)、丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 均购自南京建成生物工程研究所;核蛋白提取试剂盒 购自碧云天生物科技有限公司;兔抗Nrf2、HO-1抗体,鼠抗β-actin抗体,山羊抗兔IgG/HRP二抗 均购于美国CST公司;其他试剂 均为分析纯。

多功能酶标仪 奥地利Infinite公司;高速台式冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技有限公司;FY135型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;DHP-9052电热恒温培养箱 上海-恒科技有限公司;BS-3000A系列电子天平 上海友声衡器有限公司;光学显微镜 OLYMPUS;RM2125型石蜡切片机 德国Leica公司;垂直电泳槽、多功能成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 马齿苋多糖的制备 参考文献[15-16],称取1000 g马齿苋粗粉,加入4倍量无水乙醇浸泡24 h,抽滤,60 ℃烘干滤渣,加入10倍量的蒸馏水,80 ℃温浸2 h,共计2次,合并滤液,减压浓缩至适量,加入无水乙醇至80%,4 ℃静置过夜,抽滤,重复2次,收集沉淀,即为马齿苋粗多糖,沉淀采用蒸馏水溶解,加入适量活性炭脱色后,用Sevage试剂(正丁醇∶氯仿=4∶1),在分液漏斗充分振荡,多次除蛋白,收集上清液,然后采用减压浓缩,真空冷冻干燥,得马齿苋多糖,-20 ℃保存备用。

1.2.2 多糖含量的测定 采用硫酸-苯酚法检测多糖含量[17],以葡萄糖为标准品,以超纯水为空白对照,在490 nm处测定吸光度A,以葡萄糖标准浓度为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线:Y=0.0091X+0.1719(R2=0.9995),测定所得马齿苋多糖的含量为56.72 mg/g。

1.2.3 动物分组与给药 将60只小鼠,适应性饲养一周后,随机分为6组,即正常组、模型组、联苯双酯(200 mg/kg/d)、马齿苋多糖低、中、高剂量组(1.5、3、6 g/kg/d,生药量,参考2015年版《中国药典》[5]),各组给药体积为10 mL/kg/d体质量,每天灌胃1次,连续灌胃给药7 d。末次给药后4 h,除正常组小鼠外,其他各组小鼠腹腔注射0.2%CCl4花生油10 mL/kg,禁食不禁水24 h后,各组小鼠眼眶静脉丛取血,4000 r/min离心10 min分离血清。采血后处死小鼠并取肝脏组织用于后续实验,并计算肝脏指数[18]。

1.2.4 小鼠血清中生化标的测定 采用ELISA试剂盒,按照试剂盒做明说检测血清AST、ALT和ALP含量。

1.2.5 小鼠肝脏组织中生化指标的测定 称取适量肝脏组织,置于研磨器中,加入冰冷生理盐水,在冰水浴中进行研磨,离心,制备10%肝脏匀浆液,按照试剂盒说明书操作,检测MDA、SOD、GSH和GSH-Px含量。

1.2.6 小鼠肝脏组织形态学检测 参考文献[19],从每只小鼠各取适量肝组织,置于10%甲醛溶液中固定,24 h后,使用蒸馏水冲洗至无味,然后对其进行常规的脱水、浸蜡、包埋、切片、常规苏木素-伊红染色后,在显微镜下对其进行病理学观察。

1.2.7 Western Blot检测小鼠肝脏细胞中Nrf-2和HO-1蛋白表达 取适量小鼠肝脏组织,采用液氮研磨法,使用核蛋白提取试剂盒提取核蛋白,采用BCA试剂盒进行蛋白定量,制备样品,采用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒制备10%的分离胶和5%的浓缩胶,上样,电泳,PVDF转膜,5%脱脂奶粉封闭2 h后加一抗,抗体按照1∶1000稀释,过夜,TBST冲洗3次,加入二抗1∶5000稀释,TBST冲洗3次,ECL发光液显影,对相应条带进行灰度分析。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 马齿苋多糖对小鼠肝脏指数的影响

肝脏指数可以反映肝组织肿胀和炎性浸润程度[20]。从表1可知,与正常组相比,模型组小鼠的肝脏指数极显著性增高(P<0.01),说明CCl4导致了肝脏组织肿胀和炎性浸润,表明本实验造模成功[13,21];与模型组相比,给药组小鼠肝脏指数均下降,其中马齿苋多糖中剂量组显著性降低(P<0.05),联苯双酯组和马齿苋多糖高剂量均极显著性降低(P<0.01),说明马齿苋多糖能够改善CCl4诱导产生的肝脏组织肿胀和炎性浸润。

2.2 马齿苋多糖对小鼠肝功能的影响

如表1所示,与正常组相比,模型组小鼠血清中AST、ALT和ALP水平均极显著性升高(P<0.01),说明腹腔注射CCl4能够引起小鼠肝脏细胞损伤。与模型组相比,给药组小鼠血清中的AST、ALT和ALP水平均下降;AST水平在马齿苋多糖中、高剂量组均显著性降低(P<0.05),在联苯双酯组极显著性降低(P<0.01);ALT水平在马齿苋多糖中剂量组显著性降低(P<0.05),在联苯双酯组、马齿苋多糖高剂量组均极显著性降低(P<0.01);ALP水平在马齿苋多糖低剂量组显著性降低(P<0.05),在联苯双酯组、马齿苋多糖中剂量组和高剂量组均极显著性降低(P<0.01)。血清中ALT、AST和ALP升高被认为是判定急性肝损伤的重要指标[22],肝脏功能受损后,肝细胞中的ALT、AST和ALP大量外溢,导致其在血清中含量升高[23]。结果表明马齿苋多糖各剂量组均能降低血清中AST、ALT和ALP含量,提示马齿苋多糖能够改善CCl4诱导产生的肝脏组织损伤。

表1 马齿苋对小鼠肝脏指数和肝功能的影响

2.3 马齿苋多糖对小鼠肝组织中氧化指标的影响

如表2所示,与正常组相比,模型组小鼠肝脏组织中MDA水平极显著性升高(P<0.01),GSH-Px水平显著性降低(P<0.05),SOD和GSH水平极显著性降低(P<0.01),说明腹腔注射CCl4能够引起小鼠肝脏组织脂质过氧化损伤。与模型组相比,给药组小鼠肝脏组织中MDA水平均降低,在马齿苋多糖中剂量组中显著性降低(P<0.05),在联苯双酯组和马齿苋多糖高剂量组极显著性降低(P<0.01);SOD水平在马齿苋多糖低剂量组显著性升高(P<0.05),在联苯双酯组、马齿苋多糖中剂量组和高剂量组均极显著性升高(P<0.01);GSH水平在联苯双酯组、马齿苋多糖中剂量组和高剂量组均显著性升高(P<0.05);GSP-Px水平在马齿苋多糖中剂量组和高剂量组均显著性升高(P<0.05),在联苯双酯组极显著性升高(P<0.01)。在脂质过氧化反应过程中,机体会产生大量的MDA,从而进一步导致肝细胞损伤,加重病变,因此MDA含量的高低可以直接反映肝组织损伤的程度[24];药物的保肝性能与抗氧化能力和清除自由的能力非常密切,其中SOD、GSH和GSH-Px是机体内重要的抗氧化酶,可以通过清除代谢产生的氧自由基缓解细胞氧化损伤;因此,SOD、GSH和GSH-Px活性的高低直接影响机体清除氧自由基能力的大小[25-26]。结果表明马齿苋多糖能够降低肝组织匀浆液中MDA水平,同时升高SOD、GSH和GSH-Px水平,提示马齿苋多糖能够改善CCl4诱导产生的肝脏组织过氧化损伤。

表2 马齿苋多糖对小鼠肝组织中氧化指标的影响

2.4 马齿苋多糖对小鼠肝脏组织病理学形态的影响

如图1可知,HE染色结果显示,正常组小鼠肝小叶结构完整,肝细胞排列整齐,细胞和结构清晰,细胞无肿胀、炎性浸润等病理现象;模型组小鼠肝细胞显著变性,肝细胞肿胀,可见细胞坏死,存在严重的炎性细胞浸润现象,表明造模成功;与模型组相比,联苯双酯和马齿苋均能够明显降低肝损伤程度,明显改善肝细胞水变性、肿胀、坏死和炎性浸润等病理现象。

图1 马齿苋多糖对小鼠肝脏组织病理学形态的影响(200×)

2.5 马齿苋多糖对小鼠肝脏细胞中Nrf-2和HO-1蛋白表达的影响

如图2所示,与正常组相比,模型组小鼠肝脏组织中Nrf-2核蛋白表达水平和HO-1蛋白表达水平显著性降低(P<0.05)。与模型组小鼠相比,各给药组小鼠肝脏组织中Nrf-2核蛋白表达水平均升高,在马齿苋多糖低剂量组中表达水平显著性升高(P<0.05),在联苯双酯组、马齿苋多糖中剂量组和高剂量组中表达水平极显著性升高(P<0.01);HO-1蛋白表达水平在联苯双酯组、马齿苋多糖中剂量和高剂量组中均极显著性升高(P<0.01)。

图2 马齿苋多糖对小鼠肝脏细胞中Nrf-2和HO-1蛋白表达的影响

CCl4是一种肝毒性物质,常用于急性肝损伤动物模型的诱导,其作用机制与氧化应激有关[27],氧化应激性损伤是肝脏疾病发生和发展的重要原因之一,在肝脏中,CCl4被细胞色素P4502E1(CYP2E1)代谢为三氯甲基(CCl3·)和过氧化三氯甲基自由基(OOCCl3·)[28]。但当毒性物质大量侵袭肝脏时,自由基会过多产生,导致氧化-抗氧化系统失去平衡,自由基氧化反应过程中产生的脂质过氧化物还会进一步分解为MDA,从而导致严重的肝脏疾病[29-30]。肝脏受损后,肝细胞膜破裂,细胞内AST、ALT等酶被释放入血,造成血清转氨酶的含量急剧上升[31]。

Nrf-2/HO-1通路广泛参与心、脑、肝、肾和神经系统等组织器官的抗氧化应激损伤,是机体最重要的内源性保护体系之一。Nrf-2是细胞抵御氧化应激的一个重要转录因子,它能在活性氧或亲电试剂的刺激下,转位进入细胞核,并与抗氧化反应元件(antioxidant respon sive element,ARE)相互作用,从而诱导下游保护性Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达,达到细胞保护的作用[32]。HO-1是Ⅱ相酶中一种重要的抗氧化酶,在针对有害刺激的内源性和外源性起源细胞保护中发挥了关键作用。其抗氧化功能一方面与其阻止游离血红素参与氧化反应有关,另一方面,HO-1及其酶解产物胆红素、CO共同发挥着抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡和扩血管、改善组织微循环等作用[33-34]。因此,有效调控Nrf-2/HO-1信号通路现已成为治疗氧化应激性疾病的重要靶点[35]。

研究报道Nrf-2/HO-1信号通路的激活可以保护肝脏损伤和改善肝纤维化[36-37]。本实验研究发现,马齿苋多糖能够上调肝脏中Nrf-2核蛋白和HO-1蛋白表达水平,说明马齿苋多糖能够通过激活Nrf-2/HO-1通路改善CCl4诱导产生的肝脏组织过氧化应激损伤。

3 结论

本研究采用四氯化碳诱导小鼠建立急性肝损伤动物模型,评价马齿苋多糖对急性肝损伤的保护作用。研究结果表明,马齿苋多糖对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤具有较好的保护作用。马齿苋多糖能够降低肝损伤小鼠的肝脏指数,降低小鼠血清中的AST、ALT和ALP含量,降低肝组织匀浆液中的MDA活性,同时升高SOD、GSH和GSH-Px活性,上调肝脏组织中Nrf-2细胞核蛋白和HO-1蛋白的表达水平。因此,马齿苋多糖对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤具有较好的保护作用,其作用机制与Nrf-2/HO-1信号通路有关。