藻蓝蛋白-壳聚糖复合膜的制备及性能表征

罗爱国,赵 琪,2,马建华,杨艳君,胡变芳,*

(1.晋中学院生物科学与技术学院,山西榆次 030619;2.山西大学生命科学学院,山西太原 030006)

随着消费者对塑料包装材料安全、环保问题的担忧,食品包装材料的研发越来越趋向于可降解活性材料。研究者从动物、植物及微生物中提取分离得到多糖、蛋白及脂类等物质作为可降解包装材料[1-3]。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物,由β-(1-4)-2-乙酰氨基-D-葡萄糖和β-(1-4)-2-氨基-D-葡萄糖组成天然阳离子多糖,具有良好的成膜性、生物降解性、机械性能、选择渗透性以及一定的抑菌活性[4-5],在食品可降解活性包装材料领域、保障食品质量安全方面具有广阔应用前景。很多研究将各种天然抗菌等活性物质添加到膜中制成活性包装膜,以改善包装膜的抑菌性、抗氧化性及包装性能[6-9]。

钝顶螺旋藻(ArthrospiraplatensisGomont)为多细胞丝状蓝藻,易培养,产量大,是国内最早三大产业化藻类之一,富含藻蓝蛋白、多糖、黄酮、酚类、β-胡萝卜素和γ-亚麻酸等活性物质[10]。藻蓝蛋白的含量占蛋白总量的40%,主要由藻蓝胆素和脱辅基蛋白共价结合而成,是一种天然抑菌活性成分,且易溶于水、无毒。此外,藻蓝蛋白还具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗衰老等生理活性[11-13]。藻蓝蛋白能够抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、链球菌等生长繁殖[14-16],其抑菌谱广、抑菌作用强。

藻蓝蛋白可作为活性抗菌蛋白添加包装材料。目前有关藻类活性成分改善包装膜性能的研究很少。García-Soto等[17]将添加海藻螺旋藻添加到聚乳酸制成环保型包装膜,用于鱼类保鲜;史建如等[18]将褐藻多酚、壳聚糖及羧甲基纤维素钠制备成相容性较好、表面致密的可食膜。然而,壳聚糖膜中添加藻类蛋白是否有利于改善膜的形态与结构,值得人们研究。此外,复合膜的透光性能也是需要探索的问题之一。前期课题组利用藻类活性提取物与壳聚糖复合成膜,制备抗氧化性更强的复合可降解膜[19],同时研究了藻蓝蛋白-壳聚糖复合膜制备工艺,初步确定了复合膜比例为壳聚糖2.0%(w/v)、甘油1.0%(w/v)、乙酸为1%(w/v)。本研究将进一步考察藻蓝蛋白添加比例对藻蓝蛋白-壳聚糖复合膜的结构特性、光线阻隔性、水蒸气阻隔性、机械性能及抑菌性能的影响,探讨其作为食品活性包装膜的潜能。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

钝顶螺旋藻粉(食用级) 购于浙江一诺生物科技有限公司;壳聚糖(分子量165 kDa,低粘度,脱乙酰度95%) 西安大丰收生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯;大肠杆菌ATCC 25922 中国普通微生物菌种保藏管理中心。

EV-2600可见分光光度计 深圳市鸿永精仪科技有限公司;美国Nicolet 670傅立叶红外光谱仪 赛默飞世尔科技公司;蔡司MERLIN Compact扫描电子显微镜 德国卡尔·蔡司股份公司;CMT4204微机控制电子万能拉力机 上海恒企精密机械厂;PERMETM W3/030水蒸气透过率测试仪 济南兰光机电技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 藻蓝蛋白的提取及含量测定 藻蓝蛋白的提取参照李冰等[20]的方法,并做了部分修改。取钝顶螺旋藻粉,按料液比1∶20 (g/mL)加入10 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.0),经高速搅拌0.5 h后,先后在-18和38 ℃温度条件下静置24 h,并反复冻融三次。在7000 r/min下冷冻(4 ℃)离心0.5 h,取上清液,加入硫酸铵(饱和度50%)盐析24 h沉淀蛋白。得到蛋白沉淀再次用适量的PBS溶解,置于截留分子量为12 kDa的透析袋,在PBS中透析24 h除去铵离子,得藻蓝蛋白(AP)。AP含量的测定采用考马斯亮蓝法,以标准牛血清白蛋白建立标准曲线,得回归方程y=0.7504 x+0.0234,R2=0.9954,测得其含量为59.72%±2.60%。

1.2.2 藻蓝蛋白/壳聚糖可降解活性膜的制备 藻蓝蛋白/壳聚糖复合膜制备参照Siripatrawan等[21]的方法,并作部分修改。用100 mL 1%的乙酸溶液溶解2 g壳聚糖,并加入1 g甘油,在60 ℃水浴中磁力搅拌30 min(100 r/min),制得壳聚糖膜溶液。将AP溶于壳聚糖膜溶液中配制成浓度为0、0.5%、0.75%和1.0%(w/v)的复合膜溶液,经均质、真空脱气后,在自制成膜器(30 cm×15 cm)上流延成膜,经室温干燥24 h后揭膜,制得单一壳聚糖膜(CH-film)和藻蓝蛋白/壳聚糖复合膜(AP/CH-film),于25 ℃、相对湿度50%的干燥器中贮存备测。

1.2.3 红外光谱扫描 采用傅立叶红外光谱仪进行分析,以透射模式进行扫描,扫描范围为4000～500 cm-1,扫描次数为32次,分辨率为4 cm-1。

1.2.4 微观结构观察 将膜样品裁成5 mm×5 mm方块,用导电胶固定在铜台上,真空喷金后,用扫描电子显微镜在5 kV加速电压下,对膜样品的表面和横截面结构进行扫描观察,平面和截面的放大倍数分别为1000和5000。

1.2.5 不透明度的测定 膜不透明度的测定参照Park等[22]的方法,取样品膜在UV计600 nm波长处测定OD值,未放置样品时作为空白对照,每个样品重复测定5次,样品的不透明度用公式(1)计算:

式(1)

式中:A600为膜在波长为600 nm处的OD值;d为膜厚度,mm。

1.2.6 水蒸气透过性的测定 参照GB/T 037-1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法杯式法》[23],选择厚度均匀的膜样品,用石蜡密封于装有无水氯化钙的透湿杯口,并将透湿杯置于温度为25 ℃、相对湿度为75%的干燥器(内装饱和氯化钠溶液)中,每隔24 h称透湿杯的质量。每个样品重复测定5次。计算公式见式(2)。

式(2)

式中:Δm为t时间内的质量增量,g;d为试样厚度,m;A为试样透水蒸气的面积,m2;Δp为试样两侧的水蒸气压差,Pa;t为质量稳定后的两次间隔时间,s。

1.2.7 拉伸性能的测定 采用GB/T 1040.3-2006《塑料拉伸性能的测定》[24]方法,用微机控制电子万能拉力机测定膜的抗拉强度和断裂伸长率。将膜裁成150 mm×15 mm的矩形,测定前在25 ℃、相对湿度为50%条件下平衡2 d,用螺旋测微器测膜的中心及四角的厚度(取平均值),设定原始标距为100 mm,拉伸速率为50 mm/min,记录膜断裂时的最大长度与最大拉力。膜样品测定重复5次。计算公式见式(3)和式(4):

式(3)

式(4)

式中:Fmax为膜样品断裂时的最大拉力,N;l为膜样品宽度,mm;d为膜样品厚度,mm;l1为膜样品断裂时的最大长度,mm;l0为膜样品的初始长度,mm。

1.2.8 抑菌活性测定 参照陈桂芸等[25]的方法,并稍做修改。以大肠杆菌(Escherichiacoli,ATCC 25922)为试验菌种,用牛肉膏蛋白胨培养基培养活化,经10倍稀释法配制成菌落数为1×106CFU/mL的菌悬液。将50 ℃左右的培养基倒入培养皿,冷却20 min到凝固,加入0.1 mL菌悬液,涂布均匀制成带菌平板,将裁成直径为0.6 cm的膜样品贴于平板中央,倒置于培养箱中,在37 ℃下培养24 h后测定抑菌圈直径(十字交叉法)。实验重复测定5次,以壳聚糖膜为空白对照。

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 红外光谱分析

壳聚糖复合膜(AP/CH-film)红外光谱见图1,所有样品的红外光谱图显示相似的图谱形状,为壳聚糖膜的典型红外光谱特征。单一壳聚糖膜(CH-film)在3240 cm-1具有强吸收,主要由是-NH和-OH的伸缩振动引起;在2930 cm-1处是-CH2-基团吸收峰,2880 cm-1吸收峰是-CH3的特征吸收;1630、1550及1340 cm-1为酰胺吸收峰,在1630 cm-1为C=O伸缩振动峰(酰胺Ⅰ带)、1550 cm-1为N-H伸弯曲振动峰(酰胺Ⅱ带)及1340 cm-1为C-N伸缩振动产生(酰胺Ⅲ带);1411 cm-1吸收峰与羧酸酯基团有关,而1020 cm-1的吸收峰是C-O-C键的对称伸缩振动形成,这些典型的壳聚糖膜红外光谱特征与之前的文献报道一致[10,21,26],且在复合膜(AP/CH-film)光谱中均能被观察到。添加藻蓝蛋白复合膜光谱特征除在3240 cm-1的吸收峰向高波方向有轻微漂移外,其它位置的吸收峰强度与位置基本不变。复合膜具有相同的光谱特征和漂移情况可以推断,尽管在成膜过程中藻蓝蛋白与壳聚糖分没有共价键和化学作用的变化发生,但能形成分子间氢键[27]。与单一壳聚糖膜相比,AP/CH-film复合膜没有新峰出现,表明AP与壳聚糖相容。

图1 AP/CH-film的红外光谱图

2.2 微观结构扫描观察

膜的形态在一定程度上决定了其理化性质,AP/CH-film电镜扫描结果如图2所示。在1000放大倍数下,单一壳聚糖膜表面有明显纹理,AP/CH-film复合膜相对较为光滑平整,且这种表面形态随藻蓝蛋白比例的添加更为明显。SEM分析表明,膜表面、断面是均匀的,没有裂纹以及气孔,藻蓝蛋白与壳聚糖膜复合具有很好的相容性。与陈桂芸等制备的植物蛋白复合膜(玉米蛋白/壳聚糖)复合膜相比,AP/CH-film复合膜内外部没有明显裂纹、气孔[25];与Zhang等制备的菜籽蛋白-壳聚糖复合膜相比,AP/CH-film复合膜表面平整、无皱纹[28]。

图2 AP/CH-film的扫描电镜表面和截面图

2.3 AP/CH-film的不透明度

不透明度是影响包装膜材料总体外观和消费者接受性的重要指标。AP/CH-film的不透明度结果见表1,复合膜的不透明度随AP添加量的增加而显著增大(P<0.05)。CH-film的不透明度为1.124 Abs600·mm-1,当添加量为1.0%时,AP/CH-film的不透明度为3.927 Abs600·mm-1,增加了2.4倍。由于AP是捕光色素蛋白,与壳聚糖分子复合时,在一定程度上增加了复合膜对可见光的吸收,增大了不透明度。此外,藻蓝蛋白分子与壳聚糖大分子能够形成致密结构(见SEM结果),影响到光线透射率,同时也会增大复合膜的不透明度。AP/CH-film复合膜这种降低光线的透射性,在一定程度上会影响到肉装物的可视性,而对光敏食品具有一定阻光性。

表1 AP/CH-film的物理性质及机械性能

2.4 AP/CH-film的水蒸气透过性

包装材料的良好阻隔性是保证产品质量的主要性能之一,水蒸气透过性决定水蒸气在内外部环境中相互渗透程度,影响着产品质量。表1为AP/CH-film的水蒸气透过系数,当AP添加量为0.75%,AP/CH-film的水蒸气透过系数显著降低(P<0.05),AP的添加在一定程度增强了复合膜的水蒸气阻隔性能。复合膜水蒸气透过系数与其自身结构有关[29],AP的掺入可与壳聚糖膜分子形成更均一结构,改变了膜结构,降低水蒸气分子在膜链中迁移率,在一定程度上阻碍了水蒸气渗透性。

2.5 AP/CH-film的机械性能

膜的机械性能对于保证食品在运输与贮藏过程中的免受外力损伤等方面起着非常重要的作用[30]。如表1所示,复合膜AP/CH-film的抗拉强度随着AP的添加量增加而显著降低(P<0.05)。单一CH-film的抗拉强度为16.22 MPa,当添加0.75%AP时,AP/CH-film的抗拉强度显著减小到13.73 MPa(P<0.05);AP/CH-film断裂伸长率随AP含量增加而增大,1.0% AP/CH-film的断裂伸长率为79.73%。类似研究报道,以明胶蛋白与壳聚糖制膜,在优化配比6∶4条件下复合膜断裂伸长率可增加到30.46%[31];此外,陈桂芸等[25]发现玉米醇蛋白复合膜在壳聚糖质量分数为8%时,断裂伸长率可提高到6.67%。蛋白可增加壳聚糖复合膜的断裂伸长率,藻蓝蛋白的这种增强作用尤其明显。膜的机械性能主要与膜基质中的聚合物主链之间分子内和分子外相互作用的分布及密度有关[32]。藻蓝蛋白为水溶性高分子化合物,当与壳聚糖溶液混合成膜时,AP与壳聚糖分子间形成的作用力,使壳聚糖膜分子结构排布受到影响,改变了壳聚糖膜分子链的网络结构,致使变形抗力减小,抗拉强度降低;藻蓝蛋白分子与壳聚糖分子链能够充分缠结,交联形成更均匀的结构,这种结构对膜机械性能有积极作用[25],能够改善膜材料的柔韧性,提高复合膜的断裂伸长率。

2.6 AP/CH-film的抑菌性

图3 AP/CH-film的抑菌活性

3 结论

相比壳聚糖膜,适当添加藻蓝蛋白使得AP/CH-film复合膜在阻光性、阻湿性、延展性、抑菌性方面有所增强。1.0% AP/CH-film表面更均一光滑,具有较高的不透明性，可有效阻隔光线引起内装物成分的改变,且较低的水蒸气透过率可延长内装物水分含量稳定期;与复合其他蛋白物质相比,复合藻蓝蛋白可提高AP/CH-film的延展性,且具备较强的抗菌特性,这一特点在制备可缠绕食品保鲜包装材料、药物缓释材料等方面具有很大潜力。鉴于本研究抑菌试验菌种只有细胞大肠杆菌,复合膜在其它致病菌抑菌性能有待于进一步研究,且AP/CH-film复合膜抑菌机理及在食品保鲜中的应用也需要深入研究。