肠道微生态失衡与吗啡耐受：吗啡耐受在无菌小鼠中减弱并能被益生菌所逆转

1.前言

阿片类药物是治疗中度至重度疼痛的“金标准”。尽管阿片类药物镇痛效果好，但长期使用阿片类药物会产生多种并发症，导致其临床应用受到限制。在过去的十年中，美国阿片类药物的使用量显著增加，导致部分人群产生阿片类药物耐受。长期和反复地使用阿片类药物会导致镇痛耐受的快速出现。但是，随着阿片类药物剂量的增加，外周阿片受体的药代动力学的耐受发展缓慢，导致呼吸抑制、免疫调控、恶心和胃肠蠕动降低。长期使用阿片类药物会导致结局较差、住院时间更长、再入院率更高、以及产生更高的医疗保健费用。因此，了解与慢性阿片类药物使用相关并发症的潜在机制，并制订针对使用阿片类药物的慢性疼痛病人的具体治疗方案，是重要且迫切的。阿片类药物镇痛耐受存在多种潜在的机制：阿片受体的脱敏和表达下调、cAMP-蛋白激酶A (PKA)系统的上调、谷氨酸释放、增强的突触传递（由于降钙素基因相关肽、P 物质、去甲肾上腺素、乙酰胆碱的释放）、神经免疫的激活以及神经炎症。但是，吗啡耐受的确切机制仍未解决。肠道菌群在免疫应答和神经功能方面，起着动态的、至关重要的作用。肠道内稳态对健康有益。任何破坏有益细菌的改变都会对个体的健康产生负面影响。Toll样受体(TLRs)可识别多种微生物成分，负责先天免疫系统感知并响应改变的微生物群。因此，TLRs 在宿主与微生物群的相互作用中扮演着核心角色。

本文作者通过动物模型的研究表明，慢性阿片类药物的使用与肠道菌群的改变有关。这些发现在药物使用障碍的病人中得到了证实：他们肠道微生物组的组成和多样性与健康对照组有明显不同。作者使用多种小鼠模型证明，肠道菌群在吗啡镇痛耐受中发挥必要的作用。这些研究表明，通过制订新策略来改变肠道菌群，能够延长吗啡的有效性并且防止镇痛耐受的发生。

2.结果

（1）吗啡耐受在无菌小鼠和广谱抗生素处理小鼠减弱：首先，为了确定肠道菌群在吗啡耐受中的作用，在无菌(GF)小鼠和常规饲养的无特定病原体(SPF)小鼠上设计了完善的吗啡耐受方案，即用生理盐水或重复递增剂量的吗啡处理小鼠8 天。有趣的是，在甩尾和热板测试中，吗啡处理的GF 小鼠均显示出比SPF 小鼠更低的镇痛耐受，最大镇痛效应百分比(%MPE)分别为75%和25%。接下来，将SPF 小鼠的粪便菌群移植(FMT)给GF 小鼠，并重复上述实验。这些小鼠表现出与吗啡处理的SPF小鼠相似的、显著的镇痛耐受。

为了进一步研究肠道微生态失衡是否会导致吗啡耐受，在1 周的时间内向SPF 小鼠的饮用水添加了多种抗生素混合物，以耗竭肠道菌群，然后用递增剂量的吗啡处理小鼠8 天，均维持广谱抗生素(ABX)的处理。研究结果表明，ABX 可显著减少肠道细菌。在对ABX 和SPF 对照小鼠进行重复递增剂量的吗啡处理后发现，ABX 小鼠在第8 天的甩尾和热板实验中均显示出明显的镇痛耐受减弱(64% MPE)。在另一项研究中，每天2 次向ABX 和SPF对照小鼠注射固定剂量的吗啡共8 天。与未经抗生素治疗的小鼠相比，ABX 小鼠从甩尾实验第4 天和热板实验第5 天起，吗啡在ABX 小鼠明显具有更高的镇痛有效性。

为了进一步确定肠道菌群在吗啡镇痛耐受中的作用，使用从生理盐水或吗啡处理组小鼠中获取的菌群，对ABX 处理后的SPF 小鼠进行灌胃处理。用吗啡处理小鼠的菌群重建的小鼠，在每日注射相同剂量的吗啡后，表现出更强的镇痛耐受。相反，用生理盐水处理小鼠的菌群重建的小鼠，则显示出较弱的镇痛耐受。为了验证菌群重建的有效性，从受体小鼠中收集粪便样品进行16S 核糖体RNA (rRNA)测序。主坐标聚类分析(principal coordinates analysis clustering)显示，受体动物的微生物组与其供体动物相似。

（2）吗啡诱导的微生态失衡破坏了肠道上皮屏障，促进了全身性的细菌易位：对回肠样品的组织病理学变化进行了检查。在吗啡耐受SPF 小鼠中，观察到小肠上皮细胞受损和绒毛的炎性细胞浸润增加。相反，在吗啡处理的GF 小鼠和ABX 小鼠中，并未观察到小肠形态学损伤。在接受SPF 小鼠天然菌群的GF 小鼠中，也观察到了吗啡诱导的肠道损伤。在接受生理盐水或吗啡耐受小鼠FMT 处理的GF 或ABX 小鼠中，观察到来自吗啡耐受小鼠的FMT 足以诱导肠道的组织病理学改变，而无需直接暴露于吗啡。为了评估肠道通透性的破坏程度，将经过或未经过FMT 的SPF 和ABX 小鼠分别用异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖进行灌胃。在吗啡耐受的SPF 小鼠中观察到肠道通透性显著增加，而在ABX 处理的小鼠中，没有观察到吗啡对SPF 小鼠肠道通透性的影响。在FMT 处理的ABX 小鼠中，观察到拥有来自吗啡耐受小鼠肠道菌群的小鼠血清中FITC-葡聚糖显著增加，但是在来自生理盐水处理小鼠肠道菌群的小鼠中则未观察到此现象。接下来，评估了肠道细菌向小鼠肝脏和肠系膜淋巴结(MLN)转移的能力。在吗啡耐受的SPF 小鼠中能观察到明显的细菌易位。吗啡处理未能在GF 小鼠或ABX 小鼠中诱导细菌易位。但是，当用SPF 小鼠的天然微生物群落重建GF 小鼠，然后用吗啡进行处理时，观察到了细菌易位现象。此外，当GF 小鼠或ABX 小鼠接受FMT 时，接受吗啡耐受组微生物菌群的小鼠的细菌易位现象明显大于接受生理盐水组微生物菌群的小鼠。

（3）吗啡耐受小鼠TLR2 和TLR4 的表达水平较高：使用针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的特异性引物，通过基于凝胶的PCR 来分析肝脏中的DNA。发现革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均在吗啡耐受小鼠肝脏中发生转位。为了确定TLR2 和TLR4 在吗啡镇痛耐受中的作用，评估了这些受体在肠上皮和免疫细胞中的表达情况。在吗啡耐受小鼠中，发现肠上皮细胞和上皮内免疫细胞的TLR2和TLR4 表达显著增加。从吗啡耐受小鼠血液中分离的循环免疫细胞中TLR2 和TLR4 的表达也显著增加。而吗啡对ABX 小鼠的TLR2 和TLR4 的表达无明显影响。令人惊讶的是，吗啡增加了GF 小鼠循环免疫细胞中TLR4 的表达水平。而在ABX 小鼠中，吗啡没有增加循环免疫细胞TLR4 的表达水平。在用SPF 小鼠的天然菌群重建GF 小鼠后，吗啡能够诱导这些小鼠产生镇痛耐受，并提高了肠上皮细胞和免疫细胞中TLR2 和TLR4 的表达水平。此外，仅从吗啡耐受小鼠体内移植的菌群就足以增强TLR2 和TLR4 在GF 小鼠和ABX 小鼠中的表达。这些数据表明，TLR2 和TLR4 的激活是肠道微生态失衡和细菌易位的结果，由此产生的促炎细胞因子可能介导了吗啡镇痛耐受的发展。对TLR2 和TLR4 敲除(TLR2 KO 和TLR4 KO)小鼠重复增加剂量或重复固定剂量注射吗啡，然后进行甩尾和热板实验。发现吗啡诱导的镇痛耐受性都有了部分地减弱。虽然TLR2 和TLR4 都参与调节吗啡镇痛耐受，但是TLR2 KO小鼠的镇痛耐受有更明显的减弱，肠道屏障破坏和细菌易位更少。

（4）吗啡耐受小鼠表现出持续的慢性系统性炎症：在吗啡耐受小鼠中，使用酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法测量了肝脏、MLN 和脑中促炎细胞因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的蛋白表达水平。此外，也测定了脊髓和肠道中这些细胞因子的mRNA 的水平。在吗啡耐受小鼠检测的所有组织中，这些细胞因子水平均显著升高。然而，注射吗啡的GF 小鼠和ABX 小鼠的炎症反应较轻。接受SPF 小鼠天然菌群的GF 小鼠在吗啡处理后产生镇痛耐受，且上述细胞因子表达量较高。吗啡耐受小鼠肠道菌群的FMT 导致了GF 小鼠和ABX 受体小鼠的这些细胞因子的表达增加。如前所述，对TLR2 KO 和TLR4 KO小鼠重复注射吗啡，比同等处理的WT 小鼠引起的炎症反应要更少。因此推测IL-6 可能是吗啡耐受的炎性介质之一。为了验证这一假设，对IL-6 敲除(IL-6 KO)小鼠反复注射吗啡以诱导镇痛耐受。小鼠对甩尾实验(30.23% MPEvs.42.82% MPE)和热板实验(23.44% MPEvs.35.89% MPE)的镇痛耐受仅部分缓解。

（5）吗啡镇痛耐受导致了肠道微生物组的显著改变：对小鼠反复注射吗啡以诱导镇痛耐受。在第8 天时，收集吗啡耐受小鼠(WT、TLR2 KO和TLR4 KO)及相应的生理盐水对照组的小肠粪便内容物。提取粪便DNA，进行16S rRNA 测序。β 多样性分析结果显示，相比生理盐水处理小鼠，吗啡耐受小鼠有独特的细菌群落集群。然而，在TLR2 KO 和TLR4 KO 小鼠中，使用相同的β 多样性矩阵分析，没有发现生理盐水和吗啡处理组之间菌群谱的差异。在吗啡耐受小鼠中，放线菌门(actinobacteria)和厚壁菌门(firmicutes)的相对丰度在门水平上有所减少。此外，在科水平上，吗啡耐受动物的双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)和乳酸杆菌科(lactobacillaceae)出现了减少，在属水平上，双歧杆菌(bifidobacterium)和乳酸杆菌(lactobacillus)也出现了减少。吗啡耐受对WT 小鼠的这些影响，并没有在经过吗啡处理的TLR2 KO 或TLR4 KO 小鼠中发现。

（6）益生菌处理缓解吗啡镇痛耐受：微生物分析表明，在吗啡耐受小鼠中，代表乳酸菌科和双歧杆菌科相对丰度的操作分类学单元(operational taxonomic unit)显著降低。为了研究补充这些益生菌是否能减弱吗啡耐受，使用益生菌VSL#3 对小鼠进行灌胃处理。与对照小鼠相比，VSL#3 预处理小鼠在甩尾(34.74% MPEvs.54.23% MPE)和热板(30.04% MPEvs.51.09% MPE)实验中，显著缓解了吗啡的镇痛耐受。同样地，益生菌预处理也能缓解固定剂量吗啡重复处理后产生的耐受。通过β 多样性分析，益生菌预处理可减少慢性吗啡诱导的肠道菌群变化，这表明VSL#3 益生菌可部分恢复肠道菌群的组份。与生理盐水对照组相比，吗啡耐受小鼠体内相对丰度显著降低的细菌群落得到了显著恢复。对肠道组织学的观察显示，益生菌处理小鼠的免疫细胞浸润和肠道上皮的损伤较轻。益生菌处理可以显著减弱吗啡诱导的肠道通透性和肠道细菌向肝脏和MLN 的转位。此外，吗啡耐受诱导的肠道上皮、肠道和全身免疫细胞中的TLR2 和TLR4 表达显著增加，促炎细胞因子IL-6 和TNF-α 升高，这些指标也可以通过益生菌预处理得到改善。

3.讨论

本研究发现吗啡耐受的发展和维持存在一个恶性循环。慢性吗啡处理诱导的肠道微生态失衡通过激活TLR2 和TLR4 受体引起肠道局部炎症反应，导致促炎细胞因子（如IL-6）的产生，驱动吗啡耐受的发展。反过来，促炎细胞因子又加重肠道微生态失衡，导致肠道完整性受损和细菌易位，从而加剧炎症和维持吗啡耐受。使用益生菌恢复肠道菌群后，吗啡耐受会减弱，病理症状也会减轻。肠道微生态失衡在吗啡镇痛耐受的发展中发挥重要作用，其机制可能通过肠-免疫系统-脑轴的激活。本研究具有明确的临床意义，并揭示了益生菌预处理可以延长吗啡作为镇痛药的药效。

肠道微生物组是一个高度多样化的群落，与宿主保持着密切的关系。通过使用广谱抗生素耗竭肠道微生物组的小鼠和/或缺乏肠道微生物组的GF小鼠，已经揭示了肠道微生物组在行为、应激和疼痛调节系统以及中枢神经递质系统中的关键作用。Kang 等之前的研究表明，长期使用吗啡后，抗生素处理可防止吗啡引起的背根神经节(DRG)痛觉感受器的兴奋性降低，提示肠道微生物组是导致吗啡镇痛耐受的潜在促进因素。更多的研究表明，肠道革兰氏阳性菌产生的介体通过抗河豚毒素(TTX-R)的Na+通道来调控DRG 神经元，从而介导吗啡耐受。此外，肠道菌群也参与了小胶质细胞的激活，从而导致吗啡耐受和可卡因产生的奖赏行为的受损。为了确定吗啡耐受是否会导致肠道微生态失衡，本研究首先检测了吗啡耐受小鼠体内独特的微生物变化和这些变化的功能特征。β 多样性分析显示，吗啡镇痛耐受动物中的微生物组有明显不同，双歧杆菌(bifidobacterium)和乳酸杆菌(lactobacillus)在属水平上明显减少。双歧杆菌和乳酸杆菌是人类肠道中最基本和最常见的两种细菌。它们在维持肠道内环境稳定和肠道上皮完整性方面的作用引起了人们的特别关注。双歧杆菌和乳酸杆菌具有抗炎和抗氧化特性，在衰老和阿尔茨海默病病人中也表现出明显的下降，同时伴有肠道通透性和炎症的增加。本研究表明，这两种细菌群落的减少在肠道炎症中起着至关重要的作用，从而参与吗啡耐受。综上所述，这些研究为肠道菌群在吗啡镇痛耐受性发展中的作用提供了强有力的支持，并支持将肠道微生物组作为药物作用位点，用来延长吗啡治疗疼痛的镇痛效果。

本研究还观察到，吗啡耐受动物中这些肠道微生物群落的减少与支原体科(allobaculum)、消化链球菌科(peptostreptococcacea)和普雷沃氏菌科(prevotellaceae)的扩增有关。在吗啡耐受动物中，病原微生物扩增取得的优势和抗炎微生物的减少导致了随后肠道通透性的增加，同时也增加了细菌易位和慢性的系统性炎症。慢性阿片类药物使用与普雷沃氏菌属(prevotella)和拟杆菌属(bacteroides)的相对丰度改变有关，反过来又可能影响全身阿片类受体的功能和认知。肠道微生态失衡在慢性阿片类药物使用诱导的成瘾和认知改变中的作用，需要进一步研究。

本研究对吗啡耐受与肠道菌群失调关系的研究主要集中在免疫信号机制上。研究表明，通过调节小胶质细胞活化，吗啡诱导的肠道微生态失衡与可卡因诱导的条件性位置偏好(cocaine-conditioned place preference)和吗啡痛觉过敏存在因果关系。本研究表明，慢性吗啡处理诱导的肠道微生态失衡创造了一个炎症环境，促进肠道上皮屏障功能受损、细菌易位和促炎细胞因子上调。其他研究表明，炎症环境通过肠道神经胶质中的连接蛋白43 (connexin43)半通道来增强ATP 的释放，导致了肠胃蠕动调节功能的缺失。然而，肠道菌群也通过迷走神经、胃肠激素和微生物产生的代谢物与脑进行交流。吗啡诱导的肠道微生态失衡也可能引起吗啡代谢的改变，从而导致吗啡耐受。

益生菌作为一种恢复和维持健康状态（如过敏性疾病、腹泻、肠易激疾病、阿尔茨海默病、焦虑和抑郁）的治疗手段是有一定优势的。使用乳酸杆菌(lactobacillus)，特别是嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)治疗后，人HT-29 上皮细胞中OPRM1 的表达增加。共生细菌可以通过阿片受体控制肠神经系统的伤害性信息的传递。这些共生细菌的缺失，以及肠上皮细胞阿片受体表达的减少，可能导致了抗伤害性信号的减少和疼痛的加重。本研究发现，乳酸杆菌和双歧杆菌的减少在肠道炎症中起着至关重要的作用，并与吗啡耐受有关。益生菌通过肠-脑轴对恢复吗啡有效性具有促进作用。

本研究认为肠道微生态失衡、细菌易位、肠道和全身TLR2 和TLR4 受体激活是介导吗啡镇痛耐受的介质。TLR2 和TLR4 的激活是肠-脑轴的组成部分，促进吗啡耐受的发展。IL-6 是TLR2 和TLR4激活的下游因子，可以促进吗啡耐受。研究结果显示，在IL-6 KO 小鼠中，吗啡耐受仅有部分减弱。这说明还有其他因素可能参与吗啡耐受，包括细胞因子或趋化因子，如IL-1β、TNFα、CXCL1、IL-10、CXCL12 以及其他外周介质，如补体因子5 受体(complement factor 5 receptor, C5aR)、组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator)、神经元基质金属蛋白酶9 (neuronal matrix metalloproteinase 9, MMP9)和神经元一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)。本研究表明，益生菌疗法在吗啡治疗期间是一种有希望的、安全的、廉价的辅助疗法，有望用于缓解吗啡的镇痛耐受及延长其镇痛疗效。