基于GUM法和控制图法评定烟草中淀粉含量测定的不确定度

苏燕 蒋佳磊 陈晓水 赵攀攀 陆扬 潘力 陆明华 朱书秀

摘要：本研究分别基于《测量不确定度表示指南》规定的方法（GUM法）和控制图法对连续流动法测量烟草中淀粉含量的不确定度进行评定。结果表明：取扩展因子k=2，置信概率为95%，GUM法和控制图法评定烟草中淀粉含量分别为4.23%±0.10%和4.26%±0.54%，控制图法评定结果较大。采用GUM法建立不确定度模型，不确定度由样品质量测定、含水率测定、前处理稀释定容过程、浓度测定、测定重复性组成，其中测定重复性是最大不确定度分量。综合2种方法，推荐已确定不确定度主要来源的实验室采用控制图法进行实验室质控水平的长期评定。

关键词：连续流动法;淀粉;GUM法;控制图法;不确定度

中图分类号：TS41+1文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）05-1291-07

Abstract：According to GUM method and control chart method， uncertainty for determination of starch content in tobacco by continuous flow method was evaluated. The results showed that when the expansion factor（k） was two and the confidence probability was 95%， the content of starch was 4.23%±0.10% and 4.26%±0.54% by GUM method and control chart method respectively， the evaluation results by control chart method was larger. The model for uncertainty was established by GUM method. The uncertainty of measurement was composed of sample weight determination， water content determination， dilution and volume fixation in sample pretreatment， concentration determination and repeatability of determination. The repeatability was the main sources of the uncertainty. By comprehensive consideration of the two methods， it is recommended for laboratories which have identified main sources of uncertainty to evalute long-term quality control by utilizing control chart method.

Key words：continuous flow method;starch;GUM method;control chart method;uncertainty

淀粉是烟叶中一类重要的碳水化合物，新鲜烟叶中的淀粉含量很高，在个别品种中甚至高达40%，这也是烟叶充分成熟的标志[1]。淀粉含量在烟叶生产加工过程中变化较大，是烟叶干物质的主要组成部分，与烟叶烘烤质量、醇化品质、香型风格密切相关，一般认为淀粉是影响烟叶品质的重要因素之一[2-6]，因此烟叶中淀粉含量的测定尤为重要。目前，烟草行业采用乙醇-饱和氯化钠溶液洗涤杂质，高氯酸提取，通过淀粉与碘/碘化钾溶液反应显色的连续流动法来测定烟草及烟草制品中的淀粉含量。该方法结合了传统的高氯酸提取法、酶解连续流动法和碘显色法的优点，采用不水解而直接提取淀粉进行在线反应和检测的方法，一定程度上提高了检测效率以及结果的准确性。但是由于其测定流程仍然较为复杂，导致测量结果的重复性和再现性较差，因此有必要对该方法的不确定度进行评价。

不确定度评定方法按照理论不同分为Bottom-up（自下而上）法和Top-down（自上而下）法2类。目前，国家计量技术规范JJF1059.1-2012[7]和JJF 4.1-2012[8]中的不确定度评定均是参照文献[9]的Bottom-up法。《测量不确定度表示指南》[9]规定的方法（GUM法）需要考虑分析测量过程中涉及的所有不确定度分量，评估步骤较为繁琐，对评定人员资质要求较高，导致不确定度评定工作难以在检测实验室中广泛开展。Top-down法[10]于1995年首次提出，该方法采用顶层设计理念，在测量系统统计受控的情况下，将质量控制数据用于不确定度评价，具有较强的可操作性，许多实验室已经尝试将该方法用于物理、化学和微生物等指标的不确定度评价[11-15]。

本研究拟对连续流动法测量烟草中淀粉含量的检测过程进行综合分析，采用GUM法确定淀粉含量测定不确定度的主要来源，量化各个不确定度分量，并用控制图法对淀粉含量测定进行不确定度評定，比较2种方法评定结果的差异，以期为提高淀粉含量检测的精准度提供依据。

1材料与方法

1.1试剂、材料和仪器

试剂：氯化钠、无水乙醇、氢氧化钠、高氯酸、碘、碘化钾均购自国药集团，直链淀粉、支链淀粉标准品购自Sigma公司。

材料：原烟样品由浙江中烟工业有限责任公司提供。

仪器：实验室常规玻璃器皿（华玻实验仪器厂产品）、G3烧结玻璃砂芯漏斗（华玻实验仪器厂产品）、XS204型分析天平（感量0.1 mg，Mettler Toledo公司产品）、Futura连续流动分析仪（Alliance公司产品）、CT410旋风式样品磨（Foss公司产品）、KQ-500DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器公司产品）。

1.2试验方法

1.2.1GUM法评定淀粉含量测定的不确定度

按照文献[16]对淀粉含量进行测定：称取250 mg试验样品于50 ml G3烧结玻璃砂芯漏斗中，加入25 ml 80%乙醇-饱和氯化钠溶液，将G3烧结玻璃砂芯漏斗置于400 ml烧杯中，室温下超声萃取30 min，取出漏斗，打开旋塞弃去萃取液，用2 ml 80%乙醇-饱和氯化钠溶液洗涤残渣，将G3漏斗放回烧杯中，加入15 ml 40%高氯酸溶液超声提取10 min，再加入15 ml水洗涤。将淀粉提取液放入50 ml三角瓶中，移取5 ml于50 ml容量瓶中，加水定容，用连续流动分析仪测定。

按照GUM法分析淀粉含量测定不确定度的来源，淀粉含量测定不确定度的数学模型如下：

式中：T.A为淀粉含量;RT.A为淀粉含量平均值;urel（m）为样品质量测量引入的相对标准不确定度分量;urel（w）为样品含水率测量引入的相对标准不确定度分量; urel（v）为前处理稀释定容过程引入的相对标准不确定度分量;urel（c）为样品浓度测量引入的相对标准不确定度分量;urel（rep）为样品测量重复性引入的相对标准不确定度分量。

1.2.2控制图法评定淀粉含量测定的不确定度控制图是用于判断测定过程是否处于正常状态的一种统计工具，可直接评估“统计受控”状态下的系统数据[17]，使得实验室能够及时并持续提高检测技术水平。控制图法评定淀粉含量测定的不确定度包含4个步骤：第一，数据采集;第二，离群值检验;第三，数据正态性和独立性检验;第四，绘制控制图并计算不确定度。

2结果与分析

2.1GUM法评定淀粉含量测定的不确定度

2.1.1样品质量测定引入的相对标准不确定度分量urel（m）天平校准最大允许误差为0.50 mg，按均匀分布考虑，样品称取按2次计入，得到天平校准引入的标准不确定度u（B.C1）为：

式中，A为天平的最大允许误差。

样品称取精确至0.10 mg，分辨率引入的误差为0.05 mg，0.05 mg为线性分量，按均匀分布考虑，称质量按2次计入，可以得出天平分辨率引入的标准不确定度u（B.R1）为：

式中，U为天平分辨率引入的误差。

对样品质量测定引入的标准不确定度u（m）进行合成：

样品质量m为250.00 mg，样品质量测定引入的相对标准不确定度分量urel（m）为：

2.1.2样品含水率测定引入的相对标准不确定度分量urel（w）对样品含水率进行2次平行测定，测定结果为8.06%和8.11%，极差为0.05%，样品含水率测定引入的标准不确定度u（w）为：

式中，1.13为文献[7]中规定的2次平行测定时极差换算成标准偏差的系数;R（w）为极差。

样品含水率平均值w为8.09%，样品含水率测定引入的相对标准不确定度分量urel（w）为：

2.1.3前处理稀释定容过程引入的相对标准不确定度分量urel（v）样品前处理稀释定容过程受下列因素影响：第一，定量加液器的校准;第二，温度对定量加液器体积的影响;第三，移液器的校准;第四，温度对移液器移出液体积的影响;第五，容量瓶的校准;第六，温度对容量瓶定容体积的影响。稀释定容过程使用瓶口分配器2个，5 ml可调式移液器1个，50 ml容量瓶1个（表1）。

式中：urel（v）为前处理稀释定容过程引入的相对标准不确定度分量;urel（v1）为瓶口分配器引入的相对标准不确定度;urel（v2）为5 ml可调式移液器引入的相对标准不确定度;urel（v3）为50 ml容量瓶引入的相对标准不确定度。

2.1.4样品浓度测定引入的相对标准不确定度分量urel（c）样品浓度测定引入的不确定度分量主要受标准物质质量、标准物质纯度、标准储备液体积、标准储备液稀释、工作曲线拟合影响。直链淀粉标准物质称取质量为150.0 mg，支链淀粉标准物质称取质量为600.0 mg，参照样品质量测定引入的标准不确定度，标准物质质量测量引入的相对不确定度urel（S.m）为：

式中，m1、m2分别为直链淀粉、支链淀粉称取的质量;urel（S.m1）、urel（S.m2）分别为直链淀粉、支链淀粉质量测定引入的相对标准不确定度;u（m）为样品质量测定引入的标准不确定度。

淀粉标准物质纯度≥99.8%，按均匀分布估计，取分散区间半峰宽0.5%，标准物质纯度测定引入的相对不确定度urel（S.P）为：

式中：F1、F2分别为直链淀粉、支链淀粉标准物质纯度的允许误差（均为0.5%）;G1、G2分别为直链淀粉、支链淀粉标准物质的纯度（均为99.8%）;urel（S.P1）、urel（S.P2）分别为直链淀粉、支链淀粉标准物质纯度引入的相对标准不确定度。

称取直链淀粉和支链淀粉标准物质后，用水煮沸溶解，冷却后分别在500 ml容量瓶中定容。500 ml容量瓶的相对标准不确定度如表1显示，配制过程用到2个500 ml容量瓶，储备液体积测定引入的相对不确定度urel（S.V）為：

式中： urel（v4）为500 ml容量瓶引入的相对标准不确定度。

淀粉标准工作溶液是由葡萄糖标准储备液稀释至50 ml容量瓶中得到的。标准储备液稀释受下列因素影响：第一，容量瓶的校准;第二，温度对容量瓶定容体积的影响;第三，移液管的校准;第四，温度对移液管移出液体积的影响。在葡萄糖标准工作溶液配制过程中，使用了5个50 ml容量瓶，2根5 ml分度吸管以及2根1 ml分度吸管（表1），标准储备液稀释过程引入的相对不确定度urel（S.D）为：

式中：urel（v3）为50 ml容量瓶引入的相对标准不确定度;urel（v5）为5 ml分度吸管引入的相对标准不确定度;urel（v6）为1 ml分度吸管引入的相对标准不确定度。

淀粉的工作标准曲线为：

式中：Y为仪器响应值;X为被测物浓度;b0为工作标准曲线截距;b1为工作标准曲线斜率。

連续流动法工作标准曲线采用最小二乘法拟合，引入的标准不确定度按以下公式计算：

式中：u（C.S）为工作标准曲线拟合引入的标准不确定度;SE为残差的标准差（0.000 027 4）;b1为工作标准曲线斜率（0.001 61）;P为单水平浓度测量次数（1）;n为浓度水平数（5）;c0为样品测定平均值（90.098 4 mg/L）;c为工作标准曲线浓度平均值（90.000 0 mg/L）;SXX为统计量（8 910.030 7）。

工作标准曲线浓度平均值c为90 mg/L，工作标准曲线拟合引入的相对不确定度urel（C.S）为：

对影响样品浓度的各不确定度分量进行合成，得：

2.1.5测定重复性引入的相对标准不确定度分量urel（rep）称取同一烟叶样品，按照同样的测定程序重复测定9次，结果如表2显示。度量测定重复性引入的相对不确定度分量的方法主要有2种：贝塞尔法和极差法。

按照贝塞尔法，样品测量重复性引入的相对标准不确定度分量urel（rep1）以同一样品进行9次平行测量的标准偏差Sr（rep）和平均值RW.S表示，即：

按照极差法，9次平行测定结果的极差为R，极差系数为C，样品重复测定次数为n，则样品测定重复性引入的相对标准不确定度分量urel（rep2）为：

2.1.6合成标准不确定度u贝塞尔法合成相对标准不确定度urel1：

贝塞尔法合成标准不确定度u1：

极差法合成相对标准不确定度urel2：

式中，RT.A表示淀粉含量平均值。

极差法合成标准不确定度u2：

通过GUM法评定淀粉含量测定的不确定度包括样品质量测定、样品含水率测定、前处理稀释定容、样品浓度测定和测定重复性5个分量。测定重复性分量分别用贝塞尔法和极差法进行评定，2种方法评定出的测定重复性分量（n=9）分别占总分量的68.98%和71.01%（表2），表明测定重复性分量是对不确定度评定影响最大的因素。考察了不同测定次数下，测定重复性对不确定度评定的影响，不同测定次数下，极差法测定的不确定度重复性分量占比均高于贝塞尔法，当n=3时，两者均达到最大值，当n=9时，两者最接近。

urel（rep1）：贝塞尔法计算的样品测定重复性引入的相对标准不确定度分量;urel（rep2）：极差法计算的样品测定重复性引入的相对标准不确定度分量;urel1：贝塞尔法合成相对标准不确定度;urel2：极差法合成相对标准不确定度。

测定重复性引入的相对标准不确定度分量属于A类不确定度分量，而样品质量测定、样品含水率测定、前处理稀释定容、样品浓度测定引入的相对标准不确定度分量属于B类不确定度分量。有研究结果[17]表明，当A类不确定度分量是合成标准不确定度中唯一占优势的分量时，则测定方法的优劣与测量次数有关。从形式上看，贝塞尔法的自由度（n-1）大于极差法的自由度（v）（表2），因此贝塞尔法比极差法更可靠。理论上，贝塞尔法计算用的标准偏差应该是总体标准偏差而不是样本的标准偏差，由于重复性次数越多，样本的标准偏差越接近于总体标准偏差，因此贝塞尔法在测定次数较大时，其可靠性更好。文献[7]指出在测定次数较少时，建议采用极差法，在测定次数较多时，则建议采用贝塞尔法。综合考虑，选择贝塞尔法进行测定重复性不确定度评定，n=9时，此时标准不确定度为0.052%。

2.2控制图法评定淀粉含量测定的不确定度

2.2.1数据采集在精密度条件下，按照文献[16]规定的方法对质控样品淀粉含量进行测定，测定频率为每个月3次，连续测定12个月，记录测定数据。

2.2.2离群值检验将3×12组数据按测量时间排序，用Grubbs检验法对离群值进行检验，在95%置信度下判定36组数据无离群值。

2.2.3数据正态性和独立性检验采用Minitab软件中的游程检验判定数据是否符合独立性，游程检验中检验聚类性的近似P1值、混合的近似P2值、检验趋势性的近似P3值和检验振动性的近似P4值均大于0.05（95%的置信度），表明数据符合独立性原则。采用Minitab软件中的安德森-达令检验判定数据是否符合正态分布，经计算安德森-达令检验值为0.41，且P=0.33>0.05，表明数据符合正态性原则。

2.2.4单值移动极差（I-MR）控制图和不确定度评定结合I-MR控制图和判异规则[18]，发现数据分布不存在异常。结果（图1）表明，测量系统处于统计受控状态。计算得出质控样品淀粉含量平均值为4.26%，控制图的上、下行动限分别为5.07%和3.45%。标准不确定度u=SR=MR—1.128，式中SR为质控样品淀粉含量的期间精密度，MR—为移动极差的平均值。

控制图法评定的标准不确定度结果为0.270%，约为GUM法评定的标准不确定度的5.2倍（表3）。贝塞尔法计算重复性分量实际上为同一操作人员在同一地点采用相同仪器在短时间之内的重复测定所得。采用控制图法进行不确定度评定，反映了在过程控制稳定的前提下，实验室对于某项检测指标长期跟踪监测的结果，这种方法较其他方法所得到的不确定度更为客观，并具有统计学的严谨性。

3结论

GUM法评定烟草淀粉含量为4.23%±0.10%，取95%的置信概率，扩展因子k=2。不确定度主要由样品质量测定、含水率测定、前处理稀释定容、浓度测定、测定重复性5个分量组成，其中测定重复性分量引入的不确定度占比最大，因此测定过程中试验人员应注意对平行样品的规范操作。

控制图法评定烟草淀粉含量为4.26%±0.54%，取95%的置信概率，扩展因子k=2。该方法综合考虑了日内重复性和日间重复性，与实验室日常质量控制紧密相关，并能对质控的有效性进行评价。综合考虑2种方法，推荐已经确定不确定度主要来源的实验室采用控制图法进行实验室质控水平的长期评定。

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（责任编辑：王妮）