元素分析法测定奶粉中蛋白质含量及氮含量的不确定度评定

常伟伟，彭辉，胡冰洁

（山东理工大学分析测试中心，山东淄博，255049）

0 引 言

蛋白质是奶粉中重要的营养成分[1-2]。蛋白质含量是衡量奶粉营养价值的重要指标之一。由于蛋白质是非常复杂的有机大分子，目前还没有直接测定方法[3-4]。最常用的测定蛋白质含量的方法为凯氏定氮法[5-6]，需要经过硝化、蒸馏、滴定等步骤，才能测定出氮含量，测定的氮含量乘以换算系数6.38（参照国标GB5009.5-2016）[7]，从而计算出粗蛋白的含量。但该方法操作繁琐，费时费力。而且使用大量溶剂，造成溶剂浪费和环境污染，并且还会产生有毒气体，如果操作不当，还会对操作者的身体造成一定程度的损害。

元素分析仪是20 世纪60 年代出现的，1960 年以后，随着物化分析及电子技术的飞速发展，元素分析仪的自动化也日趋成熟。近年来，元素分析法广泛应用于化工产品、食品及药品中有机元素C、H、N、S、O的定量分析[8-11]。元素分析法测定N 元素含量的原理是依据杜马定氮法[12]，样品在高温下，氧气助燃条件下燃烧，N 元素转变为N2和氮氧化物被高纯载气带到还原管，被还原铜还原后，全部转变为N2，最后被载气吹到检测器，通过测量含氮载气和纯载气的信号差，得出氮的含量。氮含量乘以换算系数可以计算出蛋白质的含量。元素分析法具有操作简便、样品用量少、准确、快速等优点。近年来，采用元素分析法测定N元素含量，以间接测定食品中蛋白质的研究也日益增加。如：钟虹敏等[13]分别用元素分析法和凯氏定氮法测了16 种粉状食品中蛋白质的含量，两种方法测定的结果相近。蔡红燕等[14]的研究表明元素分析法测定面粉中粗蛋白含量，比凯氏定氮法准确度和精密度高。由此可见，元素分析法可以作为凯氏定氮法的替代和补充方法，是测定食品中蛋白质含量的一种简便、准确的检测方法。

测量不确定度是表征合理赋值与被测值（真值）的分散性与测量结果相关联的参数[15]，测量不确定度的大小反映了测量结果的可信程度。因此为了说明测量结果的质量，必须评定测量不确定度。通过测量不确定度的评定，还可以知道各种测量误差对不确定度分量的贡献[16]，从而控制对测量不确定度贡献较大的分量，确保测量结果的质量符合规定的用途。本文用元素分析法测定了11 种成人及婴幼儿奶粉中的蛋白质含量，并以实例对元素分析法测定N 含量的不确定度进行了评定，为更系统合理的评定元素分析法测定蛋白质含量提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与材料

元素分析仪（带80 位自动进样器）Vario EL cube，德国Elementar 公司；XP6 型微量电子天平，分度值0.001 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

对氨基苯磺酰胺标准物质（sulfanilamide,C6H8N2O2S）N: 16.25%，德国 Elementar 公司；测试样品：11 种成人及婴幼儿奶粉（见表1），市售；锡舟4×4×11 mm，德国Elementar公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验条件

CHNS 模式: 燃烧管温度: 1 150 ℃; 还原管温度:850 ℃; TCD 温度：60 ℃ 。载气：高纯 He 气（体积分数≥99.999%），流速：120 mL/min，工作压力：0.0110～0.0115 MPa; 助燃气：高纯O（2体积分数≥99.999%），氧气的减压阀调节为0.22 MPa。

1.2.2 实验步骤

（1）仪器开机，打开软件，选择模式为CHNS 模式，检漏完成后，设定燃烧管温度: 1 150 ℃; 还原管温度: 850 ℃，TCD 温度：60 ℃，升温至各温度达到工作温度。

（2）先做 n 个空白实验，至C、H、N、S 的空白峰积分面积小于100。

（3）用微量电子天平精确称量2～3 mg 对氨基苯磺酰胺标准物质，用锡舟包好压实。平行2～3 个Run in（对氨基苯磺酰胺标准物质）以使系统达到平衡，系统稳定后，再测量3 次平行的对氨基苯磺酰胺标准物质，计算日校正因子。

（4）用微量电子天平精确称量2～3 mg 待测样品，用锡舟包好压实，依次放到自动进样器对应的位置。每个样品做3 次平行。每测试20 个样品后，重复测量两次标准物质。

（5）全部测试完成后，降温，待燃烧管和还原管降到100 ℃以下后，关闭氦气和氧气，关闭软件，关闭主机。

2 结果与讨论

2.1 测定结果的准确度和方法精密度考察

采用元素分析法对11 种奶粉中蛋白质含量进行测定，每个样品均重复测定3 次。测定结果见表1。从表1 中的实验数据可以看出，蛋白质测定值与产品标示值基本一致，相对误差小于7.2%，符合蛋白质测定要求。重复3次测定结果的相对标准偏差（RSD）均小于0.36%，说明元素分析法测定蛋白质含量的精密度良好。

2.2 测定不确定性评估

以荷兰乳牛（中老年脱脂高钙益生菌）奶粉为例，对N 含量测定结果的不确定度进行了评定。

2.2.1 建立测量数学模型

奶粉中N 元素的含量的测量数学模型为：

式（2），（3）中：x 为元素分析仪测得的标准物质（对氨基苯磺酰胺）中N 元素的绝对峰面积；y 为标准物质中N 元素的绝对质量（mg）；a 为校准曲线的斜率；b为校准曲线的截距。

2.2.2 不确定度的来源

由式（1）（3）可绘制氮元素测定的因果关系图（图1），由图1 可见测量N 元素含量的不确定度的来源主要包括：称量过程产生的不确定度、对氨基苯磺酰胺标准物质的不确定度、工作曲线拟合的不确定度及测量重复性产生的不确定度。

表1 元素分析法测定奶粉中蛋白质含量（n=3）

图1 氮元素含量测定的因果关系图

2.2.3 不确定度评定

不确定度的评定区分为A 类评定和B 类评定[17]。A 类不确定度评定是通过对规定测量条件下获得的测量值的统计分析评定测量不确定度分量。B 类不确定度是根据经验和资料及假设的概率分布估计的标准偏差表征，只能用非统计分析的方法进行评定。

（1）称量过程产生的不确定度um

样品的质量的不确定度是由称量过程带来的。样品的质量m，实际上是用配衡体称量法通过2 次称量所得，即有一次去皮（回零）所得：

式中：m皮=m1：没有装样品时空锡舟的质量（mg）；m总=m2：样品与锡舟总质量（mg）。

（a）没有装样品的空锡舟质量m1的不确定度u（m1）评定

m1的不确定度来自两方面：第一，由天平称量不准引入的标准不确定度uB1（m1），按B 类方法评定；第二，天平分辨力引入的标准不确定度uB2（m1），也是按B 类方法评定。

在本实验中使用的电子天平的最大允许误差±0.001 mg，服从均匀分布，则包含区间半宽度am01=0.001 mg，包含因子由此引起的不确定度uB1（m1）为

由天平说明书可知其分辨力为0.001 mg，服从均匀分布，区间半宽度am02=0.0005 mg，包含因子km02=由此引起的标准不确定度uB（2m1）为：

则m1称量的合成标准不确定度

(b) 质量m2的不确定度 u（m2）评定

质量m2的标准不确定度的评定与质量m1的标准不确定度评定方法相同。因此质量m2的标准不确定度分量u（m2）为：

(c) 质量m 的不确定度um评定

质量m1和m2是用同一台电子天平测量的，是相关量。但是m 是m1和m2差值，其系统偏差被抵消，m 的不确定度采用方和根的方法进行合成，即：

（2）标准物质的不确定度us

标准物质产生的不确定度属于B 类不确定度，本实验使用的标准物质对氨基苯磺酰胺按照标准物质证书上给出的N 元素百分含量wstd=16.25% ± 0.04%，由于没有关于不确定度的其他说明，按均匀分布处理，其区间半宽度astd= 0.04%，则由标准物质对氨基苯磺酰胺引起的N 元素的不确定度为：

（3）工作曲线拟合的不确定度uw

本次校准采用一次线性方程式(2)：y=ax+b，另外，证书中标准物质对氨基苯磺酰胺的N 元素百分含量为16.25%，对氨基苯磺酰胺中N 元素绝对质量y 还可以通过N 元素百分含量乘以称量质量mstdi得到，即：

式中mstdi为i 次称量的标准物质质量；wstd为标准物质中N 元素的百分含量（16.25%）。

在日常分析中，需要用标准物质测得的日校正因子f 对校准曲线进行调整。f 是日常测试标准物质后，理论值wthe与日常测试值wact之比，即

因此，计算实际样品中N 元素的绝对质量时，实际使用的校准曲线为式（3）：y=f×(ax+b)。

通过测量一系列的标准物质xstdi，绘制标准方程为：

式中yi是标准物质对于xi的用式（13）计算得到的值，为x=xi时用式（16）计算得到的值；n 为绘制标准曲线的实验点数（n=20）。

本次实验对样品荷兰乳牛（中老年脱脂高钙益生菌）奶粉进行了10 次测量，以式（3）为定量依据，得到样品中N 元素的绝对质量y0。最小二乘法拟合标准曲线校准得出x0时，所产生的的标准不确定度：

式(18)-(20)中，i 为测试编号；绝对质量的平均值；绘制标准曲线所用全部 ystdi的平均值；为全部xstdi的平均值；a 为校准曲线的斜率（a=3.059×10-5）；b 为校准曲线的截距(b=9.212×10-4)；p 为样品测试次数（p=10）；n为绘制标准曲线的实验点数（n=20）；日校准因子f=1.009。

由校准曲线引起的相对不确定度uw,rel为：

（4）测量重复性引起的不确定度ur

在相同条件下，称取10 份荷兰乳牛（中老年脱脂高钙益生菌）奶粉，进行N 元素含量测定（测定结果见表2），测量重复性引起的不确定度属于A 类不确定度，可以用统计方法计算其不确定度。因此，由测量重复性带来的不确定性ur为：

其中，sr为样品测量结果的标准偏差；p 为样品的测量次数（p=10）。

wN为测量的样品奶粉中N 元素百分含量的平均值。计算结果见表2。

（5）测定奶粉中N 含量的合成标准不确定度uc

以荷兰乳牛（中老年脱脂高钙益生菌）奶粉为例，采用元素分析仪测定奶粉中N 元素含量的相对合成不确定度为：

将有关数据代入公式（24）可以得出N 元素的合成标准不确定度，见表3。

（6）测定奶粉中N 含量的扩展不确定度UN

扩展不确定度是用来评判测量方法或测量结果是否值得相信的量化参数。相对扩展不确定度用合成标准不确定度乘以一个大于1 的包含因子（k）表示，置信（包含）水平P 为95%时，取包含因子k=2, N 元素含量的相对扩展不确定度为：

表2 测量重复性引起的标准不确定度分量

表3 元素分析法测定荷兰乳牛奶粉中N元素含量的不确定度评定结果

采用元素分析法测定荷兰乳牛奶粉的N 元素含量的扩展不确定度为：

则本实验中所测荷兰乳牛（中老年脱脂高钙益生菌）奶粉中N 元素含量及不确定度表示为(3.560 ±0.15)%，k=2, 置信水平P=95%

3 结 论

采用元素分析法测定了11 种奶粉中蛋白质含量，测量结果表现出很好的准确度和精密度。并以荷兰乳牛（中老年脱脂高钙益生菌）奶粉为例，评定了元素分析仪测定N 元素含量的不确定度，不确定度主要来源于标准曲线拟合，其他不确定度贡献从大到小依次为测量重复性、标准物质、及称量过程。元素分析仪测定N 元素含量的扩展不确定度为0.15%（k=2, 置信水平P=95%）。在使用元素分析仪测试元素含量时，选用元素含量与待测物含量尽可能接近的校准物质、增加标准曲线中的实验点数、使用误差小的天平等有助于减小不确定度，增加测试结果的可信度。