老年尖锐湿疣患者光动力治疗前后外周血淋巴细胞及细胞因子测定

宣晓梅 董伟兰 王贝贝 石丽平 陈立荣 林琳 张国强

(河北医科大学第一医院皮肤科，河北 石家庄 050031)

尖锐湿疣(CA)是人乳头瘤病毒感染导致的复发率较高的性传播疾病，近年来老年CA患者逐渐增多，其皮疹重、发病时间长，治疗依从性差，严重影响其心理健康及生活质量。研究表明CA发病、复发与机体的免疫尤其是细胞免疫功能密切相关〔1,2〕，特别是淋巴细胞及相关的细胞因子。目前CA常见治疗方法包括外用药、二氧化碳激光、光动力(ALA-PDT)治疗等〔3〕，其中ALA-PDT治疗除了直接去除疣体外还可以有效清除乳头瘤病毒亚临床感染和潜伏病灶，降低尖锐湿疣的复发，尤其适用于耐受性较差的老年CA患者。本文主要探讨老年CA患者外周血淋巴细胞及细胞因子情况及ALA-PDT治疗后各指标变化。

1 资料与方法

1.1临床资料 2016年1月至 2019年3月来河北医科大学第一医院皮肤科门诊就诊的老年CA患者117例，其中男69例、女48例，年龄60～71岁，平均(64.7±2.3)岁，病程1.5～6.2个月，平均(3.43±2.05)个月。初发组82例，其中男53例、女29例，年龄60～68岁，平均(63.1±10.5)岁，病程1.0～5.9个月，平均(2.65±1.31)个月；复发组35例，其中男16例、女19例，年龄63～71岁，平均(65.7±3.8)岁，病程3.0～7.4个月，平均(4.17±1.56)个月。入选病例均符合CA诊断标准并做病理证实。男性皮疹多见于阴茎、肛周；女性皮疹多见于会阴联合及阴唇内侧。皮疹数量数个至数十个，大小为粟粒至指甲盖大小不等。排除标准：有自身免疫性疾病、恶性肿瘤、合并其他性病或者感染性疾病、严重肝肾功能不全、近半年内应用糖皮质激素等免疫抑制剂或者免疫调节剂者、光过敏者。另外选取医院体检中心同年龄段健康体检者30例作为健康对照组。受试者均按要求签署知情同意书。

1.2主要试剂和仪器 荧光标记单克隆抗体和溶血素均为美国BD公司产品；细胞因子试剂为杭州赛基生物科技有限公司生产；流式细胞仪FACSCalibur为美国BD公司生产；5-氨基酮戊酸(ALA)为上海复旦张江生物医药股份有限公司生产；XD-635AB型光动力激光治疗仪由上海复旦张江生物医药股份有限公司技术开发监制，桂林市兴达光电医疗器械有限公司生产，输出波长为635 nm±3 nm，终端输出光功率0～300 mW，连续可调。光纤耦合输出，输出模式为连续输出。

1.3方法

1.3.1血液标本采集 老年CA患者于治疗前及3次ALA-PDT治疗后抽取空腹静脉血10 ml；健康对照组于入组时抽取空腹静脉血10 ml。

1.3.2流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比值 取流式管并用移液器在其底部分别加入：CD4-异硫氰酸荧光素(FITC)抗体20 μl、CD8-藻红蛋白(PE)抗体20 μl、CD3-别藻青蛋白(APC)抗体10 μl、CD45-多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)抗体10 μl，然后加入100 μl全血，震荡混匀10 s，避光静置15 min；加入溶血素500 μl，震荡混匀10 s，避光静置10 min；加入500 μl鞘液，震荡混匀10 s，避光静置5 min；500 r/min离心5 min，弃上清，用滤纸吸干管壁液体；最后加入500 μl鞘液，震荡混匀10 s，上机检测。

1.3.3流式细胞术检测B细胞、自然杀伤(NK)细胞比值 取流式管并用移液器在其底部分别加入CD3-FITC/CD(16+56)-PE抗体20 μl、CD19-APC抗体10 μl、CD45-PerCP抗体10 μl，然后加入100 μl全血，震荡混匀10 s，避光静置15 min；其余步骤同T淋巴细胞亚群测定。

1.3.4流式细胞术检测细胞因子浓度 将捕获微球混合液，漩涡震荡3～5 s，以每个样本25 μl标准取于试管中并标记，1 800 r/min离心5 min后弃掉上清，再取等量微球缓冲液重悬微球，漩涡震荡3～5 s后避光孵育30 min;将标准品管转移至试管，加入2 μl样本稀释液，静置15 min，并标记为最高标准品浓度；取 10只试管，标记为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、0(即阴性对照)，每管加入 300 μl样品稀释液;从最高浓度标准品管中吸取 300 μl样本至 1∶2 管，吹打混匀，再从1∶2管中取 300 μl样品至 1∶4 管，吹打混匀，如此类推，直到 1∶512管;0管加入300 μl磷酸盐缓冲液(PBS);取上样管，依次标记为标准品管、阴性对照、样本管，按说明书对应关系依次放置；标准品管中加入25 μl对应浓度的标准品，阴性对照管中加入25 μl阴性对照样本，样本管中各加入 25 μl待检测样；向所有标准品管及样品管中分别加入25 μl荧光检测试剂;将孵育好的捕获微球震荡混匀后，向所有标准品管及样品管中分别加入25 μl，震荡混匀，室温避光孵育2.5 h。孵育完成后，每管加入 1 ml PBS 洗涤，1 800 r/min离心5 min，弃上清，每管再加入 100 μl PBS，震荡重悬后上机检测。将上机所得数据导入 FCAP3.0.1，绘制标准曲线，并测得待检测样本结果。

1.3.5ALA-PDT治疗疣体 用温敏凝胶将 ALA 粉末稀释成20%新鲜溶液。常规消毒清洁患处(尤其宫颈阴道、直肠内)，将灭菌棉片或棉条沾满药液敷于皮损处，然后纱布、保鲜膜封包、胶布固定3 h。用ALA-PDT治疗仪局部照射20 min，光板距离皮肤2～6 cm；光纤外用套管，根据皮损部位和患者耐受情况不同，能量密度设定60～100 mW/cm2。嘱患者保持体位，闭上双眼，带好专用防护眼镜，勿移动身体，密切观察局部皮肤反应和患者有无不适。每周1次治疗，连续治疗3次。

1.4统计学处理 应用 SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组ALA-PDT治疗前、后外周血淋巴细胞及细胞因子水平比较 治疗前CA组总T、CD4+、NK细胞、B细胞百分比及CD4+/CD8+值、细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ浓度均低于健康对照组，且复发组低于初发组，差异有统计学意义(均P<0.05)；但CD8+百分比、IL-10和TNF-α浓度高于健康对照组，且复发组高于初发组，差异有统计学意义(均P<0.05)。ALA-PDT治疗后比较CA组总T、CD4+、NK细胞、B细胞百分比及CD4+/CD8+值、细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ浓度均有所升高，但仍低于健康对照组(均P<0.05)，初发、复发两组上述指标中除细胞因子IFN-γ浓度无显著差异外(均P>0.05)，其余指标复发组仍低于初发组(均P<0.05)；CD8+百分比、IL-10和TNF-α浓度有所下降，但仍高于健康对照组，且复发组仍高于初发组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表1、表2。

2.2ALA-PDT治疗后有无皮疹比较 有皮疹组总T、CD4+、NK细胞、B细胞百分比及CD4+/CD8+值、细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ浓度仍低于无皮疹组(P均<0.05)，CD8+百分比、IL-10和TNF-α浓度仍高于无皮疹组，差异均有统计学意义(P均<0.05)；但无皮疹组总T百分比、细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10浓度与健康对照组比较无明显差异(P均>0.05)，见表1、表2。

表1 各组治疗前后外周血淋巴细胞比值

表2 各组治疗前后外周血细胞因子浓度

2.3ALA-PDT治疗效果 ALA-PDT治疗后CA患者皮疹完全消退率70.53%；有22例未坚持治疗而失访，占比18.80%，其中初发组17例、复发组5例。

2.4不良反应 治疗过程中有10例出现局部溃烂、感染不良反应，通过局部处理后伤口痊愈，占比8.55%。

3 讨 论

近年来我国CA发病一直维持在较高水平〔4〕，并且老年CA患者逐年增多，且其皮疹严重、发病时间长、治疗依从性差，造成复发率高、治疗周期延长。

人外周血淋巴细胞由T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞组成。T细胞主要参与细胞免疫，包括CD4+T细胞与CD8+T细胞，正常情况下CD4+/CD8+值>1。其中CD4+T细胞因能分泌多种细胞因子，分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α，主要调节细胞免疫功能，分泌IL-4、IL-6、IL-10，主要调节体液免疫功能。CD8+T细胞属直接效应细胞，在CD4+T细胞辅助下，可以直接清除病毒感染细胞、胞内菌感染细胞、支原体、衣原体、肿瘤细胞等。B细胞主要参与体液免疫，依靠产生的抗体与抗原结合后，为NK细胞识别而发生抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用，而且补体也可以与抗原抗体结合物引起吞噬细胞杀死病原体。NK细胞也属于直接效应细胞，参与非特异性免疫应答，可以直接清除病毒感染细胞、胞内菌感染细胞、支原体、衣原体、肿瘤细胞等，也可以在B细胞产生的抗体辅助下杀死以上病原体。因此通过测定外周血淋巴细胞百分比及细胞因子浓度，可以了解患者免疫状态。

研究表明CA发病、复发主要与患者细胞免疫功能密切相关，有学者在CA 患者疣体组织中发现免疫抑制相关或免疫异常分子〔5,6〕，而且患者外周血细胞因子和淋巴细胞也出现异常〔7～9〕。老年人本身基础代谢率降低，免疫功能下降，更容易患病毒、细菌、真菌等感染性疾病〔10～12〕，而且患病后免疫功能变化更加复杂，直接影响疾病的发展和转归〔13,14〕。

ALA-PDT治疗中光敏剂吸收特定波长的光线后将疣体内的氧分子激活为具有较高能量的单线态氧，后者在从高能态回归到基态的过程中释放的能量，引起增生的角质形成细胞程序性死亡〔15〕，导致疣体坏死、脱落以达治疗目的；同时也可通过激活T淋巴细胞增强了CA患者局部免疫功能〔16〕，减少复发。ALA-PDT治疗作为目前治疗CA重要方法之一，有效性及安全性已经得到学者和临床医师广泛认可〔17～19〕。本研究也显示3次ALA-PDT治疗后老年CA患者皮疹消退率高达70.53%，疗效确切。但同时不良反应也有增加，达8.55%，且费用相对偏高，因经济原因影响部分老年CA患者治疗依从性，失访率高达18.80%。

本研究结果说明老年CA患者患病时免疫功能整体趋势是降低的，但同时也是有选择性的，有利于清除病毒感染的指标不同程度升高，包括可以直接清除病毒感染细胞的CD8+T细胞 ；活化吞噬细胞、抗病毒的TNF-α；增强B细胞分化的IL-10。

本研究结果说明治疗后整体免疫功能有所改善，但仍不及同年龄组健康人群。ALA-PDT治疗后皮疹完全消退组患者的免疫功能包括细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫改善显著，但也是有选择性的。

综上，外周血淋巴细胞及细胞因子的变化可能与老年CA发病、复发密切相关；ALA-PDT可以有效治疗老年CA，外周血淋巴细胞比例及细胞因子浓度变化可能是其机制之一。但ALA-PDT治疗、CA皮疹消退及外周血淋巴细胞及细胞因子的变化三者间确切的因果关系需要进一步研究。