原料脂肪氧化程度对西式培根安全品质的影响

姜 皓,杨 璐,徐文怡,杨 华,马俪珍,*

(1.天津农学院食品科学与生物工程学院,天津市农副产品深加工技术工程中心,天津 300384;2.天津农学院动物科学与动物医学学院,天津 300384)

在培根的加工过程中通常会加入亚硝酸盐,起到促进发色、抑菌、抗氧化、赋予肉制品特有的风味的作用[1]。但是,在腌肉制品加工的弱酸性条件下,亚硝酸盐易与蛋白质分解产生的二级胺类物质发生亚硝化反应,生成强致癌物N-亚硝胺(N-nitrosoamines,NAs)[2]。影响NAs形成的因素有很多,大量研究显示,脂肪的氧化程度是影响亚硝化反应的重要因素,脂肪的氧化产物丙二醛可以促进NAs的形成[3]。熊凤娇等[4]报道,在模拟体系中,脂肪的氧化程度与N-亚硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine,NDMA)、N-亚硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine,NDEA)和N-亚硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine,NPYR)的形成有正相关关系。此外,脂肪是由脂肪酸组成,脂肪氧化程度不同,脂肪酸组成也就不同,对NAs形成的作用效果也就不同。

在肉制品这一富含脂质与蛋白质的复杂体系中,脂肪氧化与蛋白氧化不是孤立发生的,一种物质的氧化会促进另一种物质的氧化。脂肪氧化产生的自由基或者氢过氧化物等物质会攻击蛋白质的敏感氨基酸侧链或者直接与蛋白质反应使蛋白氧化[5-6]。而肌红蛋白氧化过程中会产生超氧阴离子[7],它迅速发生歧化反应生成H2O2,这些活性氧物质不仅可以自身促进脂肪氧化,还可以与肉制品中的铁发生反应生成羟自由基,具有促进脂肪氧化的能力[8];并且肌红蛋白还可以与脂肪氧化的初级产物氢过氧化物反应生成超铁肌红蛋白加速脂肪的链式反应[9]。

在实际生产中,由于在运输、贮藏、零售、消费等过程中冷链技术不健全[10],温度的波动幅度比较大,使得新鲜肉类在被消费者食用之前一直在进行着反复冻融的过程,意味着脂肪与蛋白质不断进行着相互促进的氧化,肉制品的安全品质也会受到影响。本试验通过反复冻融法制备三组氧化程度不同的原料脂肪,与绞碎的新鲜猪瘦肉混合制成西式培根产品，建立培根这个脂肪-蛋白质的体系,探究脂肪的氧化程度对西式培根的NAs、生物胺形成量、蛋白氧化程度等安全品质产生的影响,为培根的安全生产提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜猪背部肉、猪肥膘 购于天津市康宁肉制品有限公司;食盐、白糖、鸡蛋、味精、白酒、葡萄糖 购于天津市红旗农贸综合批发市场;复合磷酸盐、卡拉胶 购于郑州凯之裕食品添加剂有限公司;亚硝酸钠、抗坏血酸钠、烟酰胺、大豆分离蛋白粉均为食品级 购于郑州裕和食品添加剂有限公司;二氯甲烷(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、氯化钠、无水硫酸钠 天津市风船化学试剂科技有限公司;高氯酸、丙酮、丹磺酰氯、硼砂、亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、硫代巴比妥酸(thiobarbital acid,TBA)、三氯乙酸、硫酸、氯化钾、DTNB、尿素 国药集团化学试剂有限公司;9种N-亚硝胺标品:NDMA、NDEA、NPYR、N-亚硝基甲乙胺(N-nitrosomethylethylamine,NMEA)、N-亚硝基二丁胺(N-nitrosodibutylamide,NDBA)、N-亚硝基二丙胺(N-nitrosodipropylamine,NDPA)、NPIP、N-亚硝基吗啉(N-nitrosomorpholine,NMOR)、N-亚硝基二苯胺(N-nitrosodiphenylamine,NDPheA) 美国Sigma公司;8 种生物胺标品:色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺及亚精胺 美国Sigma公司;PE薄膜 市售。

7890A气相色谱仪(配备氮磷检测器)、1260高效液相色谱仪(配备紫外吸收检测器) 美国安捷伦公司;PB-10酸度计 德国赛多利斯科学仪器有限公司;RE-2000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;DW-5120低温泵 上海振捷实验设备有限公司;LLJ-A10T1搅拌机 广东小熊电器有限公司;HS07-314恒温水浴锅 天津华北实验仪器有限公司;BJRJ-82绞肉机、BVBJ-30F真空搅拌机、BYXX-50烟熏炉、不锈钢网状模具 浙江嘉兴艾博实业有限公司;ST 40R离心机 美国Thermo公司;18Basic匀浆机 德国IKA公司;FA2004精密电子天平 上海精科仪器公司;TU-1800紫外分光光度计 日本Hmadzu公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培根氧化模型的构建

1.2.1.1 氧化脂肪的制备 以猪背膘为对象,用切片机切成薄片,一组为新鲜猪背膘、其余两组的猪背膘分别为通过3次和7次的反复冻融循环(-18 ℃冷冻18 h然后室温(20 ℃)解冻到中心温度达到5 ℃,放回-18 ℃继续冷冻)得到不同氧化程度的脂肪,以硫代巴比妥酸反应产物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)为指标,得到TBARS含量分别为0.04、0.09、0.30 mg/kg的脂肪氧化模型。

1.2.1.2 腌制液配制 以5 kg原料肉计,配制1 kg腌制液:在1 kg香料水(花椒、大料、小茴香等五香风味)中,添加食盐90.0 g、复合磷酸盐15.0 g、亚硝酸钠0.6 g、抗坏血酸钠2.5 g、白糖50.0 g、大豆分离蛋白粉8.0 g等。配制好在0～4 ℃冷库中提前冷却。

1.2.1.3 工艺流程 原料肉的选择→瘦肉绞碎→腌制→压膜→蒸煮→脱模→干燥→烟熏→冷却→速冻→切片→真空包装→食用前煎烤

1.2.1.4 操作要点 原料选择:选取猪背部的纯精瘦肉,剔除筋膜、碎肉等,用绞肉机绞碎(3 mm筛板)。

腌制:将配制好的腌制液与绞碎的猪瘦肉和肥肉片在真空搅拌机中搅拌均匀,放入0～4 ℃的冷库中腌制24 h。

压模:在清洗干净的不锈钢网孔模具上铺一层PE薄膜,将腌制好的肉馅装入,固定好磨具盖的卡扣。

蒸煮、脱模:将压模完成的培根放入烟熏炉中在85 ℃的条件下蒸煮90 min,取出、冷却、脱模。

干燥、烟熏、冷却:将脱模后的培根再次放入烟熏炉中在65 ℃条件下干燥60 min,然后在55 ℃的条件下烟熏5 h,取出冷却。

速冻、切片:将加工好的培根在-35 ℃速冻箱中速冻1 h,取出用冻肉切片机切成2 mm的薄片,真空包装。

烤制:将切好的培根薄片放烤盘中,放入烤炉,在200 ℃温度条件下煎烤5 min。

1.2.2 试验设计方案 试验分为3组,每组总肉量为1.8 kg,肥肉占总肉量(肥肉片+绞碎瘦肉)的比例为20%,按照1.2.1培根氧化模型的构建方法加工出3组培根,添加不同氧化程度的脂肪:F0组(TBARS值为0.04 mg/kg),F1组(TBARS值为0.09 mg/kg),F2组(TBARS值为0.30 mg/kg),取成品(The finished product,FP点)和煎烤后(Bake,BA点)样品真空包装,速冻1 h(-35 ℃速冻箱中),在-80 ℃冷库中贮存,立即测定pH、色差、亚硝酸盐残留量和TBARS值,并于一个月内测定完总巯基、羰基、8 种生物胺、9 种NAs含量和脂肪酸含量等所有指标。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 pH测定 参照GB 5009.237-2016《食品安全国家标准食品pH的测定》[11]。

1.2.3.2 红度的测定 将培根绞碎,用色差仪测定红度。

1.2.3.3 亚硝酸盐测定 参照GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[12]测定亚硝酸盐残留量。

1.2.3.4 TBARS值测定 参考Faustman等[13]的方法。

1.2.3.6 羰基含量的测定 羰基的含量测定参考Delles等[15]的方法。

1.2.3.7 生物胺测定 参照杜智慧等[16]的方法测定样品中的8种生物胺。标准储备液及标准溶液的配制:准确称取色胺、腐胺、苯乙胺、尸胺、酪胺、组胺、亚精胺、精胺标品各50 mg,用0.4 mol/L的高氯酸定容至50 mL棕色容量瓶中,配制成1 mg/mL储备液备用。分别取以上标准品储备液,用0.4 mol/L的高氯酸配制成终浓度分别为1.0、5.0、10、20、100 μg/mL的混合标准溶液,采用铝箔避光、4 ℃保存。

样品处理:称取5 g待测样品加入20 mL 0.4 mol/L的高氯酸进行研磨,4 ℃、4000 r/min条件下离心10 min,重复离心2次,合并上清液用0.4 mol/L的高氯酸定容到50 mL。

标准溶液和样品的衍生化:分别取1 mL上述生物胺标准混合溶液和样品溶液,依次加入0.2 mL的2 mol/L NaOH、0.3 mL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲,2 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯溶液,40 ℃水浴避光反应30 min。反应结束后加入100 μL氨水终止反应,取出残留的丹磺酰氯溶液。用乙腈定容至5 mL,4 ℃、3000 r/min条件下离心5 min,上清液过膜,待上机检测。

色谱条件:使用安捷伦1260高效液相色谱仪测定。色谱柱为Agilent Zorbax Extend-C18column(4.6 mm×150 mm),DAD检测器在254 nm下检测,流速为1 mL/min,进样量20 μL,柱温30 ℃,流动相A为水、流动相B为乙腈。梯度洗脱。

1.2.3.8 NAs测定 参照GB 5009.26-2016《食品安全国家标准食品中N-亚硝胺类化合物的测定》[17]对样品中的NAs进行提取、萃取净化、浓缩后过滤膜(0.45 μm)。气相色谱条件:不分流进样量1 μL;进样口温度250 ℃;柱箱升温梯度:50 ℃保持4 min,10 ℃/min升至180 ℃保持2 min,20 ℃/min升至220 ℃保持10 min,后运行以240 ℃保持3 min;氮磷检测器温度330 ℃;氢气流速3 mL/min,空气流速60 mL/min,载气(N2)流速8.5 mL/min。过滤膜后的样品用上述气相色谱条件测定9种N-亚硝胺含量,同时进行外标法分析定量。用甲醇将9种N-亚硝胺混合标准储备液(200 μg/mL)配制成浓度为20、10、8、5、2、1、0.8、0.5、0.2 μg/mL的混合标准溶液,根据保留时间定性,以9种N-亚硝胺混合标准溶液的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。根据标准曲线得到样品中N-亚硝胺的浓度。

1.2.3.9 脂肪酸组成测定 参照GB/T 5009.168-2016《食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》[18],使用气相色谱仪测定培根的脂肪酸组成。色谱条件:氢火焰离子化检测器(flame ionization detector,FID);H P-INNO WAX毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);检测器温度300 ℃;进样口温度250 ℃;载气为氮气;进样量1 μL。

当年，明朝的边将李成梁，在抚顺一带守边。明朝朝廷呢，挺好，在东北设挺多马市，当中就有清原马市、抚顺关马市。那时候马市，每个月定期开放两次，让女真人和汉人交换物品，就像现在的自由市场。朝廷呢，在边关收税，明朝朝廷的规定挺好，都正常交税。可是守关的明军，欺负、勒索女真人，女真人野性，不服他们勒索，就跟守关的明军干仗，仇也越积越深。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件计算平均值和标准差,用Statistix 8.1软件中Tukey HSD程序进行显著性分析,SigmaPlot 10.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根pH的影响

原料脂肪氧化程度的不同对西式培根pH的影响如图1所示。从图1可以看出,两个取样点(FP点和BA点)的pH随着原料脂肪氧化程度的提高有降低的趋势(P<0.05),pH由高到低的顺序依次为F0>F1>F2。这主要是由于脂肪氧化产生的自由基会促进蛋白氧化,产生羰基化合物进一步氧化生成酸类物质,羰基分子之间形成醇醛缩合物,蛋白质羰基与氨基酸之间形成甲亚胺等,从而降低体系的pH[19]。同样的,在西式培根煎烤过程中,由于高温会加速脂肪和蛋白的氧化导致BA点的pH比FP点的pH低。

图1 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根pH的影响

2.2 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根红度的影响

原料脂肪氧化程度的不同对西式培根红度的影响如图2所示。由图2可知,随着原料脂肪氧化程度的增加,两个取样点培根的红度值均呈降低趋势。Cameron等[20]指出随着脂肪氧化的一级产物和二级产物的增加,高铁肌红蛋白的积累也逐渐增多,与本试验结果一致,分析其原因是由于脂肪对蛋白的氧化作用,使肉中的肌红蛋白逐渐被氧化成高铁肌红蛋白,颜色变为褐色,导致红度值降低。在煎烤过程中,培根的红度值显著升高(P<0.05),这是因为高温条件下会发生美拉德反应,使产品呈现诱人的亮红色。

图2 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根红度的影响

2.3 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根亚硝酸盐残留量的影响

原料脂肪氧化程度的不同对西式培根亚硝酸盐残留量的影响如图3所示。由图3可知,3组氧化程度不同的原料脂肪对西式培根中亚硝酸盐残留量的影响中F0、F1组与F2组存在差异。FP点,3组样品的亚硝酸盐残留量分别为30.19、30.91和29.76 mg/kg,煎烤后亚硝酸盐残留量虽有下降趋势,但除F1组外,其余两组差异不显著(P>0.05)。刘万臣等[21]的研究报道,加工肉经热处理工艺后,亚硝酸盐的残留量有降低的趋势,本研究与其报道稍有不同,这有可能是加工的肉样品不同的缘故。

图3 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根亚硝酸盐残留量的影响

2.4 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根TBARS值的影响

原料脂肪氧化程度的不同对西式培根TBARS值的影响如图4所示。TBARS值是通过测定脂肪次级氧化产物(丙二醛)来表示脂肪氧化程度,TBARS值越高,说明脂肪氧化程度越强。随着原料脂肪氧化程度的增加,西式培根在煎烤前后TBARS值都有升高趋势,且BA点样品的TBARS值显著高于FP点(P<0.05),分别增至0.13、0.14和0.27 mg/kg,说明高温会加速西式培根中脂肪的氧化程度,氧化中间产物进一步反应生成了次级产物丙二醛。顾伟钢等[22]也指出经过高温水焯和低温慢炖后原料肉脂肪氧化程度明显增加,致使TBARS值升高。

图4 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根TBARS值的影响

2.5 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根总巯基含量的影响

原料脂肪氧化程度的不同对西式培根总巯基含量的影响如图5所示。肉制品中蛋白氧化会导致蛋白分子间各种作用力被破坏,巯基会被暴露出来,生成二硫键,进而导致巯基的总量降低。从图5可以看出,随着原料脂肪氧化程度的加深,西式培根煎烤前后的总巯基含量呈现降低的趋势(P<0.05)。由此可知,原料肉脂肪的氧化程度越高,西式培根的总巯基含量越低,说明原料脂肪的氧化加速了原料瘦肉中蛋白的氧化进程。Xiong等[23]认为蛋白氧化与脂肪氧化具有类似的自由基链式反应,脂肪氧化产生的过氧化物能促进蛋白氧化。同样的,由于煎烤加速了西式培根脂肪的氧化,导致BA点样品蛋白氧化程度加深,总巯基含量就更低,F0、F1和F2组的总巯基含量分别降至10.64、10.57和9.08 nmol/mg。这与赵冰等[24]在不同氧化程度的脂肪促进肌原纤维蛋白氧化模型中得到的结果一致。

图5 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根总巯基含量的影响

表1 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根生物胺含量的影响

2.6 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根羰基含量的影响

蛋白的羰基含量的高低是反映蛋白氧化程度最显著的指标之一。原料脂肪氧化程度的不同对西式培根羰基含量的影响如图6所示,随着原料脂肪氧化程度的增加,培根的羰基含量呈现显著上升的趋势(P<0.05),且BA点羰基含量显著高于FP点,F0、F1和F2组的羰基含量分别增至1.03、1.12和1.49 nmol/L,说明不同氧化程度的原料脂肪会显著影响西式培根中蛋白的氧化程度(P<0.05)。在脂肪氧化进行自由基链式反应的同时攻击蛋白质敏感氨基酸侧链,使蛋白容易发生变性、聚合等反应,最终导致羰基含量增加[25]。Sylvie等[26]认为蛋白质和脂质氧化具有相同的催化剂,它们既可以单独进行,也可以相互作用。

图6 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根羰基含量的影响

2.7 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根生物胺含量的影响

生物胺是一类具有生物活性、含氨基的低分子质量有机化合物的总称,是生物体内正常的活性成分,在体内起着重要的生理作用,如促进生长、增强代谢活力、加强肠道免疫系统、并在神经系统中有活性、控制血压等[27]。但生物胺作为亚硝化反应的前体物影响NAs的形成。原料脂肪氧化程度的不同对西式培根生物胺含量的影响如表1所示。3组样品均未检出苯乙胺、腐胺和亚精胺。BA点各组组胺含量有升高趋势,F0、F1和F2组的组胺总量分别增至33.23、29.78和33.78 mg/kg。精胺本身自然存在于食品中。尸胺是赖氨酸在脱羧酶的作用下脱羧的产物,尸胺的形成与肠杆菌数量存在显著相关性,并不是只与腐败作用有关,生物活体在生命代谢中也会产生少量的尸胺,组胺与尸胺在调节核酸与蛋白质的合成及生物膜稳定性方面起着重要作用。各组均可以检测到精胺与尸胺。组胺被认为是生物胺毒性最强的一种,其次是酪胺,但适量的组胺可以参与局部免疫反应,调节肠道生理功能等作用。部分国家对食品中组胺含量做了相关标准,FDA规定食品中组胺小于500 mg/kg是比较安全的含量范围;欧盟规定食品中组胺含量不得超过100 mg/kg,酪胺含量不得超过100～800 mg/kg。三组培根的组胺和酪胺含量都没有超过安全标准,不会对人体造成危害。随着原料脂肪氧化程度的提高,培根中总生物胺的含量有上升的趋势。有些学者认为生物胺的含量与原料肉的品质有关[28],由于脂质与蛋白氧化造成西式培根中蛋白质分解成游离氨基酸,蛋白酶作用蛋白质形成的氨基酸脱羧酶活性增强造成西式培根品质的下降,致使西式培根总生物胺含量上升。

2.8 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根NAs形成量的影响

原料脂肪氧化程度的不同对西式培根NAs形成量的影响见表2所示。由表2可以看出,煎烤前后培根中NDMA的含量均随着原料脂肪氧化程度的增加显著升高(P<0.05),在FP点三组NDMA含量分别达到2.84、4.05、4.09 μg/kg。从NAs的总量来看,随着脂肪氧化程度的增加有升高的趋势,FP点三组NAs含量分别达到17.25、17.27、18.23 μg/kg,但F0与F1组差异不显著(P>0.05),F2组显著增加(P<0.05)。分析三组样品在煎烤前后NPYR的变化时发现,煎烤后NPYR的含量均会升高,分别为1.29、1.23和1.61 μg/kg,这是因为NPYR的生成与温度有关,温度越高,越容易生成NPYR[29]。Herrmann等[30]研究发现,热处理对NPIP形成有明显的促进作用,本试验中F2组在BA点的NPIP含量显著高于FP点(P<0.05)。由此可见,在西式培根中存在脂肪与蛋白交互氧化的过程,并且有某些物质促进了NAs的生成,但其机理亟待进一步研究。

表2 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根NAs形成量的影响

表3 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根脂肪酸含量的影响

2.9 原料脂肪氧化程度的不同对西式培根脂肪酸含量的影响

氧化程度不同的3组原料脂肪在加工培根的2个工艺点脂肪酸含量的变化见表3所示。由表3可以看出,三组西式培根SFA以及MUFA含量较高,PUFA含量较少,其中棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸为主要脂肪酸。这与刘登勇等[31]对五花肉红烧后测定的结果相近。而对于各种脂肪酸在含量上存在的差异,可能是由猪的品种、年龄以及西式培根的加工方式与红烧肉的加工方式不同所致。原料肉在加工过程中脂肪含量和脂肪酸组成都会发生一定程度的变化,在西式培根的加工过程中,随着原料脂肪氧化程度的增强,PUFA的含量呈显著降低趋势(P<0.05),且三组西式培根在BA点的PUFA含量均低于FP点(P<0.05),所以F2组的BA点PUFA含量最低(300.38 mg/100 g),这一结果与Duckett等[32]研究发现加热可以降低多不饱和脂肪酸的含量结果一致。顾伟钢等[22]研究了红烧肉加工过程脂肪酸的变化情况,发现SFA的含量在炖煮过程中显著下降。在本试验中,F0和F1组的BA点的SFA含量均低于FP点,与顾伟刚的研究报道一致。Skrypec等[33]报道原料肉中不饱和脂肪酸的比重越大,培根中NPYR的含量就会越高。本试验中F2组的BA点,不饱和脂肪酸总量(MUFA+PUFA)最高(3962.82 mg/100 g),这可能是由于F2组中所添加的原料脂肪氧化程度最高(TBARS为0.30 mg/kg),脂肪氧化反应十分复杂,多不饱和脂肪酸氧化后大部分转化成了单不饱和脂肪酸,导致不饱和脂肪酸的总量较高,但多不饱和脂肪酸含量是三组中最低的。在西式培根的加工过程中,脂肪酸进一步氧化和分解,导致脂肪酸组分发生变化,进而又促进了NAs的形成,所以F2组BA点的NAs总量为组内最高值(21.91 μg/kg,见表2所示)。Mirvish等[34]发现氮氧化物与脂肪酸反应产物能与胺类物质反应形成NAs,但关于脂肪与氮氧化物的反应机制亟待深入研究。

3 结论

本试验研究了西式培根加工中,脂肪的不同氧化程度对西式培根终产品煎烤前后各品质指标的影响。结果表明,随着原料脂肪氧化程度的提高,西式培根(FP点)的pH、红度、总巯基含量、多不饱和脂肪酸含量呈现降低的趋势(P<0.05);煎烤后(BA点)的pH、总巯基含量以及PUFA的含量低于煎烤前(FP点),相反培根在BA点的红度值高于FP点。不同氧化程度的原料脂肪对西式培根煎烤前后的亚硝酸盐残留量影响不显著(P>0.05)。TBARS、羰基含量、总生物胺含量、NDMA含量随着原料脂肪氧化程度的升高有增加趋势,在煎烤后(BA点),NPYR、NPIP、组胺含量显著升高(P<0.05)。试验说明,在西式培根的实际生产中应严格控制原料肉的新鲜程度,以确保西式培根产品的品质和安全性。