哮喘患儿血清外泌体中miR-7b表达变化及其临床意义
2020-12-09王静赵怡然刘晓佳田中燕
王静,赵怡然,刘晓佳,田中燕
唐山市妇幼保健院,河北唐山063000
支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞和细胞组分参与的,以气道慢性炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病[1],是儿童呼吸系统的常见病、多发病。近年随着环境污染加重,我国儿童哮喘的发病率呈明显上升趋势。由于儿童家长对哮喘的认识不足、临床医师的规范化管理水平参差不齐,我国儿童哮喘的总体控制水平尚不理想[2]。外泌体是直径30~200 nm的脂质双层膜结构微小囊泡,能够携带多种蛋白质、脂类和核酸,可作为信号分子传递给其他细胞,从而改变其他细胞的功能,在免疫监视﹑炎症反应及肿瘤分子信号转导等生理和病理生理过程中发挥重要作用[3-4]。近年研究发现,微小RNA(miRNA)可参与气道变应性炎症的发病过程,并且哮喘患者支气管肺泡灌洗液中外泌体所包含的miRNA表型与健康人明显不同[5-6]。因此,外泌体miRNA有可能成为哮喘潜在的非侵入性分子生物标志物。微小RNA-7b(miR-7b)是最新发现的miRNA,定位于11号染色体,能够参与急性肺损伤炎症反应的调节和修复过程,其机制可能与抑制IL-12表达、促进TNF-α表达有关[7-8]。因此,miR-7b被认为是炎症反应的一个重要调节分子。但目前外周血外泌体中miR-7b表达与儿童哮喘的关系尚不清楚。本研究观察了哮喘患儿血清外泌体中miR-7b表达变化,并探讨其临床意义。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料 选择2019年1—12月唐山市妇幼保健院收治的哮喘患儿48例(观察组)。所有患儿入院时处于急性发作期,入院后经吸入性糖皮质激素联合长效β2受体激动剂规范治疗进入临床缓解期。哮喘诊断和分期依据《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[9]。纳入标准:①符合哮喘诊断标准;②年龄4~12岁;③初诊;④临床病历资料完整。排除标准:①合并其他呼吸系统疾病者;②合并先天性气道疾病者;③合并心、肝、肾等重要脏器严重疾病者。同期选择因其他疾病在唐山市妇幼保健院住院的患儿48例(对照组),排除有过敏性疾病史或哮喘家族史者,有反复呼吸道感染史者以及入组前1个月内出现呼吸道感染者。观察组男30例、女18例,年龄(8.9±2.7)岁;对照组男29例、女19例,年龄(8.8±2.3)岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经唐山市妇幼保健院医学伦理委员会批准,所有患儿监护人知情同意。
1.2 血清外泌体中miR-7b表达检测 观察组分别于入院次日和临床缓解1个月后,对照组于入院次日,采集清晨空腹肘静脉血5 mL,室温下静置30 min,1 500 r/min离心10 min、离心半径8 cm,留取上层血清,-80 ℃保存。取部分血清,采用外泌体RNA分离试剂盒(exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit)提取血清外泌体及其RNA。提取外泌体RNA后,按Thermo ScientificTMRevertAidTM反转录试剂盒说明进行反转录,获取cDNA。反转录条件:16 ℃ 15 min,42 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。以cDNA为模板,进行PCR扩增。引物序列由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。引物序列:miR-7b上游引物5′-AACCCGUAGAUCUUGGAUCCUG-3′,下游引物5′-CAACAUCAUCUACGGUUUGGGU-3′;β-actin上游引物5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′,下游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。PCR扩增体系共25 μL:10×Taq Buffer 2.5 μL,2 mmol/L dNTP Mix 2.5 μL,上下游引物各1 μL,25 mmol/L MgCl21.5 μL,5 U/μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 15 μL。PCR反应条件:95 ℃ 10 min,93 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s共40个循环。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCT法计算miR-7b相对表达量。实验重复3次,取平均值。
1.3 血清IFN-γ、IL-4检测 取上述-80 ℃保存的血清,采用ELISA法检测血清IFN-γ、IL-4,检测仪器为Stat-fax-2100酶标仪。ELISA试剂盒均购自上海优尔生科技股份有限公司。所有操作严格按试剂盒说明进行。血清IFN-γ、IL-4水平的最低检测值均为0.5 ng/mL,IFN-γ ELISA试剂盒的组间和组内变异系数分别为3.5%、5.5%,IL-4 ELISA试剂盒的组间和组内变异系数分别为4.5%、6.5%。实验重复3次,取平均值。
2 结果
2.1 两组血清外泌体中miR-7b表达及血清IFN-γ、IL-4水平比较 见表1。
表1 两组血清外泌体中miR-7b表达及血清IFN-γ和IL-4水平比较
2.2 急性发作期哮喘患儿血清外泌体中miR-7b表达及血清IFN-γ、IL-4水平的关系 急性发作期哮喘患儿血清外泌体中miR-7b表达与血清IFN-γ水平呈负相关关系(r=-0.36,P<0.01),与血清IL-4水平呈正相关关系(r=0.69,P<0.01),而血清IFN-γ水平与血清IL-4水平无明显相关性(r=0.51,P>0.05)。见图1A~C。
图1 急性发作期哮喘患儿血清外泌体中miR-7b表达及血清IFN-γ、IL-4水平的关系
2.3 血清外泌体中miR-7b表达对儿童哮喘的诊断价值 ROC曲线分析显示,血清外泌体中miR-7b表达诊断儿童哮喘的曲线下面积(AUC)为0.858(95%CI:0.749~0.907),其截断值为1.81,此时其诊断儿童哮喘的敏感度为81.9%、特异度为87.3%,见图2;血清外泌体中miR-7b表达用于鉴别儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的AUC为0.801(95%CI:0.733~0.889),其截断值为2.27,此时其鉴别儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的敏感度为74.5%、特异度为72.9%,见图3。
图2 血清外泌体中miR-7b表达诊断儿童哮喘的ROC曲线
图3 血清外泌体中miR-7b表达鉴别儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的ROC曲线
3 讨论
流行病学调查报道,我国儿童哮喘患病率在以每10年增加50%以上的幅度上升;及时诊断并接受规范化治疗是控制儿童哮喘最有效的方式[10-11]。哮喘是一种以气道慢性炎症、气道高反应性和气道重塑为特征的异质性疾病,Th1/Th2型细胞因子失衡在哮喘发病过程中起重要作用。Th1、Th2型细胞因子分别由Th1、Th2型细胞产生并分泌,IL-12可刺激并诱导T细胞和自然杀伤细胞产生IFN-γ,IFN-γ能够刺激Th1、Th2型细胞因子分泌,从而形成一个正向反馈,进而抑制哮喘气道炎症和浸润过程[12]。因此,深入研究哮喘的发病机制对提高哮喘患儿的诊治水平具有重要意义。
外泌体可由机体内包括免疫细胞、癌细胞在内的多种细胞分泌,其囊泡内含有大量的蛋白质、脂质和核酸成分。外泌体不仅是一种稳定有效的细胞间信号传递和交换递质,还可调节细胞和器官功能。外周血循环中的核酸序列,由于容易受到核酶及外源性物质的影响和干扰,不容易稳定存在于外周血循环中。相对于外周血循环中不稳定的核酸序列,外泌体中的核酸序列具有高度稳定性且较少受到循环中其他来源的核酸序列干扰,被认为是疾病诊断的一种理想生物标志物[13-14]。有研究报道,外泌体亦参与哮喘的发病过程。过敏性哮喘患者痰液外泌体中RNA,包括miRNA、长链非编码RNA,其表达在过敏原刺激前后可发生明显变化,提示外泌体中RNA是一种潜在的哮喘诊断生物标志物[15]。miR-7b是近年发现的miRNA家族成员之一。有研究报道,miR-7b能够参与肺部炎症反应的损伤和修复过程,其作用是通过降低IL-12表达和促进TNF-α表达实现的[8],而IL-12、TNF-α在哮喘发病过程中具有重要作用。因此推测,血清外泌体中miR-7b可能参与哮喘的发病过程。但目前相关报道较少。
本研究结果显示,观察组急性发作期和临床缓解期血清外泌体中miR-7b相对表达量均高于对照组,并且观察组急性发作期血清外泌体中miR-7b相对表达量高于临床缓解期,提示miR-7b可能参与哮喘的发病过程。目前认为,Th1/Th2型细胞因子比例失衡是哮喘发病的重要机制之一[16]。本研究结果发现,观察组急性发作期和临床缓解期血清IFN-γ水平均低于对照组,血清IL-4水平均高于对照组,但观察组急性发作期血清IFN-γ水平低于临床缓解期,血清IL-4水平高于临床缓解期。提示无论是在哮喘急性发作期还是临床缓解期,血清中由Th1型细胞分泌的IFN-γ减少,而由Th2型细胞分泌的IL-4增多,即在外周血循环中存在Th1/Th2型细胞因子失衡。TIAN等[17]报道,与临床缓解期比较,急性发作期哮喘患者血清miR-1和IFN-γ水平明显降低,而血清IL-4水平明显升高。本研究结果发现,急性发作期哮喘患儿血清外泌体中miR-7b相对表达量与血清IL-4水平呈正相关关系,与血清IFN-γ水平呈负相关关系,而血清IFN-γ水平与血清IL-4水平无明显相关性。提示血清外泌体中miR-7b表达能够反映血清IL-4、IFN-γ水平,miR-7b有可能通过调节与Th1/Th2型细胞因子平衡相关的IFN-γ、IL-4水平参与哮喘的发病过程。
有研究报道,血浆外泌体中miR-125b表达能够用于哮喘诊断和病情程度鉴别[18]。由此推测,外周血中外泌体miRNA对哮喘诊断和鉴别诊断具有较好的临床价值。本研究评估了血清外泌体中miR-7b表达对儿童哮喘诊断和鉴别诊断的效能,结果发现血清外泌体中miR-7b表达诊断儿童哮喘的AUC为0.858,其敏感度为81.9%、特异度为87.3%;而血清外泌体中miR-7b表达用于鉴别儿童哮喘急性发作期和临床缓解期的AUC为0.801,其敏感度为78.5%、特异度为74.9%。提示血清外泌体中miR-7b表达亦能用于儿童哮喘诊断和鉴别诊断,有望成为儿童哮喘辅助诊断的一种生物标志物。
综上所述,哮喘患儿血清外泌体中miR-7b表达升高,并与血清IFN-γ、IL-4水平存在一定相关性;血清外泌体中miR-7b表达可作为儿童哮喘诊断或鉴别诊断的生物学指标。