miRNA 在口腔正畸领域研究进展

张媛媛 王小玢 胡泊洋 田玉楼

作者单位：110002 沈阳，中国医科大学口腔医学院·附属口腔医院，辽宁省口腔疾病重点实验室（田玉楼为通讯作者）

miRNA 是一类内源性长度约为 22 个核苷酸的保守序列非编码 RNA，miRNA 通过与靶 mRNA 的3'端非翻译区相结合，影响靶 mRNA 的稳定性或抑制其翻译，从而对靶基因进行转录后表达的调控。miRNA 特异性调控细胞生长、细胞分化、细胞凋亡，进而调控机体的生长发育、疾病的发生发展。本文就 miRNA 在机械力、成骨分化、破骨破分化方向的研究现状进行论述，阐明 miRNA 在正畸牙齿移动过程中的研究进展。

一、miRNA 与正畸牙齿移动

正畸牙齿移动的机理是机械外力作用于牙齿产生张力侧和压力侧，压力侧 RANKL 表达上调，导致破骨细胞分化及骨吸收，同时张力侧成骨生长因子（TGF-β、OPG）等表达升高，促使 MSCs 分化为成骨细胞从而导致骨的新生，两者处于相对平衡状态并最终导致牙齿位置的移动[1]。牙齿移动正是在成骨细胞的骨形成作用与破骨细胞的骨吸收作用这样一个成骨 - 破骨的动态平衡中进行。

Chen 等[2]发现 miR-21 通过靶向 PDCD4 调控下游基因 C-fos，从而调控正畸牙齿移动过程中压力侧与张力侧的破骨细胞生成及张力侧成骨分化，进而影响正畸牙齿移动。另外，Liu 等[3]进行大鼠牙齿移动动物实验发现 miR-503-5p 在张力侧牙槽骨中表达明显降低，体内过表达 miR-503-5p 后，成骨标志基因 Runx2、ALP mRNA 水平和蛋白水平的表达也下降，牵张侧牙槽骨骨形成受到抑制。表明miR-503-5p 在大鼠牙齿移动过程中对牵张侧牙槽骨形成起重要的负性调控作用。Yu 等[4]在大鼠正畸牙齿移动过程中，发现 MiR-34a 可增强正畸作用力下的牙槽骨重塑，使 Runx2、ColI 表达升高、牙槽骨合成代谢指数上调从而降低正畸牙齿运动速度。

二、miRNA 与机械力

机械外力是正畸牙齿移动的主要手段，也是调节骨形成与牙周改建的重要因子[5]。体外实验证明，在机械力引起的细胞功能变化中，miRNA 起到重要作用。周期性拉伸可以促进 miR-21 表达，在机械力作用下，人来源 PDLSCs 的成骨分化能力增加，且随着时间延长，miR-21 表达升高。并且 miR-21 通过靶向调控 ACVR2B，从而调节 PDLSCs 成骨细胞的分化[6]。在 miRNAs 响应机械力影响牙周膜干细胞研究中发现，在压力作用后的 PDLSCs 中，miR-146a下调 NF-kappa B 信号通路，进而调控 PDLSCs 的成骨分化能力，NF-kappa B 信号通路在成骨分化中有重要作用[7]。在压力作用下的 PDLSCs 中，miR-218靶向下调 RUNX2 来调控 PDLSCs 的成骨分化[8]。Liu等[3]在实验过程中通过 miRNA 基因芯片筛选出在牵张力诱导下大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中表达有明显变化的 miR-503-5p，并验证了其对骨髓 间充质干细胞向成骨细胞分化的抑制作用。Qi等[9]对流体剪切力诱导的牙周膜细胞成骨分化样本芯片检测发现 6 种 miRNAs 的表达变化具有统计学意义，并进行 RT-PCR 验证。Wu[10]等通过机械张力引导 PDLCs 向成骨分化，高通量测序结果发现 9 种成骨相关的 miRNAs 表达有显著差异，并进行大鼠牙齿移动动物实验显示有 6 种 miRNAs 变化有统计学意义。Zuo[11]的研究则发现牵张力敏感的 miR-103a通过作用于基因 Runx2，降低 Runx2 蛋白水平表达，进而抑制在周期性牵张力作用下诱导的成骨细胞分化及骨形成。同时在吊尾小鼠的研究中发现miR-103a 在骨组织的表达升高，降低 miR-103a 的表达可缓解缺乏力刺激所导致的骨丢失。流体剪切力 可通过对 miR-23b-3p 的抑制作用使E-Tmod41的表达上调，从而促进血红蛋白形成过程中 F- 肌动蛋白细胞骨架的重塑[12]。另外，也有研究表明，在牵 张力作用下诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化过程中，miR-218、miR-191 * 、miR-3070a 和 miR-33表达变化明显，这些 miRNAs 对应力反应敏感[13]。在张应力作用下，miR-154-5p 通过靶向Wnt/PCP 通路阻止脂肪来源的间充质干细胞的成骨分化[14]，miR-195-5p 靶向WNT3A、FGF2、BMPR1A 抑 制PDLSCs 的成骨分化[15]。

三、miRNA 与骨平衡

目前，已确认多种 miRNA 在骨形成过程中起重要的调控作用，在动物胚胎时期的骨形成阶段、骨骼发育阶段以及成熟阶段的过程中起到非常重要的作用[16]。特异性敲除 miRNA 合成所需的 Dicer 酶基因小鼠，会出现所有 miRNA 形成的缺陷，这些基因缺陷小鼠出生时骨骼大小明显比正常小鼠小，表明miRNAs 在动物胚胎发育时对骨形成发挥重要调控作用[17]。骨质疏松症是全身性骨代谢异常导致的疾病，临床 研 究发现，在骨质疏松 患 者骨组织中，miR-21，miR-23a，miR-24，miR-25，miR-100 和miR-125b 呈现明显高表达。这既表明 miRNAs 在骨质疏松中有明显提示作用，又提示它在骨平衡中有重要作用[18]。

1.miRNA 与成骨分化：研究发现一些特异性miRNAs 及其作用靶点，通过调节靶基因 mRNA 的表达，从而调控成骨分化中某些重要信号通路的关键调节因子及受体表达水平[19]。Zhang 等[20]研究发现，miRNA-335-5p 能够直接对Wnt通路抑制剂DKK1 产生负性调控作用，从而促进 C3H10T-1/2、MC3T3-E1、MLO-A5、MLO-Y4等多种成体干细胞的成骨向分化过程。Tilde Eskildsen 等[21]向人骨髓间充质干细胞内转染 miRNA-138 过表达质粒时，其骨形成能力随之下降，而当向人骨髓间充质干细胞内转染 miRNA-138 siRNA 后，其骨形成能力增强，提示 miRNA-138 与成骨密切相关。同时利用荧光素酶报告基因技术检测发现 miRNA-138 的靶基因是点状黏附激酶（FAK），miRNA-138 通过抑制 FAK的表达，使 FAK-ERK1/2 信号通路受到抑制，最终抑制人骨髓间充质干细胞成骨的分化。过 表 达miRNA-20a 可特异性沉默 PPARγ，Bambi 和 Criml（PPARγ 是 BMP/Runx2 信号通路的负性调节因子，而 Bambi 和 Criml 是 BMP 通路的拮抗剂），同时证明，miRNA-20a 可靶向 PPARγ，并与 BMP 信号通路协同调节人间充质干细胞的成骨分化[22]。Itoh T等[23]利用鼠前体成骨细胞 MC3T3-E1 作为实验对象，使用 BMP-2 诱导 MC3T3-E1 细胞的成骨分化，同时将 miR-141 和 miR-200a 转染到经诱导后的细胞当中，实验结果发现 Dix5mRNA 表达明显降低，提示 miR-141 和 miR-200a 在翻译水平上对 Dix5发挥抑制作用。Wang 等[24]在老年骨折患者中发现骨组织骨量显著降低，检测骨组织发现 miRNA-214表达水平升高。体内试验进一步证实 miRNA-214对骨的形成具有负向调节作用，同时经过体外实验发 现 miR-214可通过靶向调节转录激活因子4（ATF4），从而抑制成骨分化。Fan 等[25]的研究表明miR-221-5p 可通过靶向 smad3 来调控骨髓瘤骨病的成骨分化。在 miR-221-5p 抑制后，PI3K/AKT/mTOR 信号通路被激活，从而增加间充质干细胞成骨分化能力。Xu 等[26]研究骨质疏松症患者中 miR-889 的表达高于健康组，miRNA-889 靶 向WNT7A 通过 Wntβ-catenin 信号通路抑制成骨细胞的分化。在PDLSCs 的成骨分化过程中，miR-132水平下调。miR-132通过靶向GDF5以及激活NF-κB 轴来抑制成骨细胞的分化[27]。

2.miRNA 与破骨分化：破骨细胞是体内唯一进行骨吸收活动的细胞，具有显著溶骨、吞噬和消化能力，在牙槽骨吸收过程中具有重要作用，miRNAs 可通过影响转录因子的表达，直接或间接地调控破骨细胞代谢及分化[28]。

Sugatani 等[29]利用分子生物学技术在小鼠单核 /巨噬前体细胞向破骨细胞分化过程中成功分离出miRNA，基因芯片的检测结果发现在前体细胞分化过程中 miR-21 的高表达差异具有显著性，并且证实在 RANKL 的调控下，miR-21 在破骨细胞分化中发挥至关重要作用。在 RANKL 诱导的破骨细胞分化过程中，上调的 c-Fos 可使miR-21上调，上调的miR-21 使 PDCD4蛋白表达水平下降，即c-Fos/miR-21/PDCD4 通路在调控破骨细胞分化过程至关重要。在 RANKL诱导的骨髓巨噬细胞（BMMs） 向破骨细胞 分 化 的 过 程 中，Fumitaka Mizoguchi 等[30]发 现 miR-31明显高表达，其表达 含量是 BMMs 中的 18 倍，并采取小干扰 RNA 特异性抑制 BMM，发现 miR-31 表达明显降低，同时发现RhoA 作为 miR-31 的靶基因明显上调。抑制 RhoA的表达可以明显的修复 miR-31 下调引起的破骨细胞损害，进而抑制骨吸收。Kurowska 等[31]通过敲除骨髓巨噬细胞（BMMs）的 Dicer 基因，发现 miRNA-155的表达下降，并上调其靶基因 SHIP，破骨细胞的形成 明显减少。Guo 等[32]发现在 RANKL 和 M-CSF 诱导 CD14+PBMCs 向破骨细胞分化的过程中，miRNA-125a 的表达明显降低，另外，miRNA-125a高表达使破骨细胞的形成受阻，并且抑制 TRAF6 及NFATc1 的表达。Ce Dou 等[33]发现在 RANKL 与M-CSF 诱导的 RAW264.7 细胞向破骨细胞分化的过程中，miR-7b 的表达明显下降。进一步实验研究发现 miR-7b 通过降低靶基因 DC-STAMP 的表达，从而抑制 Nfatc1，c-Fos，Akt，Irf8，Mapk1 和 Traf6 等其它融合基因和关键调节因子的表达，进而发挥着调控破骨 细 胞的分化及其前体细 胞 的融合作用。Youngkyun Lee 等[34]研究发现在 RANKL 诱导的小鼠骨髓巨噬细胞 （BMMs） 分化中，miR-124 表达降低，BMMs 被 pre-miRNA-124 转染后，通过抑制NFATc1 的表达从而调控 BMMs 向破骨细胞分化。Kim 等[35]发现在破骨细胞前体中 miRNA-26a 抑 制剂能通过上调 CTGF 的表达水平从而促进破骨细胞的生成，导致骨吸收发生。Zhao 等[36]发现骨髓巨噬细胞来源的破骨细胞分化过程中，miR-340 通过靶向MITF，下调 MITF 的 mRNA 及蛋白水平，从而抑制破骨细胞的分化。Li 等[37]在绝经后骨质疏松症患者血清中检测发现 miR-133a 上调，并与患者的腰椎骨密度呈负相关。体外实验进一步证明下调 miR‐133a 可以抑制 RANKL 诱导的破骨细胞形成，动物实验可减少去卵巢大鼠的骨丢失。

四、miRNA 与炎症反应

miRNA 可通过影响免疫细胞的分化、成熟以及功能来调节自身免疫和炎症反应，从而参与多种炎症相关性疾病[38]。正畸牙齿移动是周期性牙周膜和骨组织吸收和重塑的过程，同时也是非感染性、微创伤性的炎症反应过程，在该过程中，炎症细胞激起分泌的炎症相关因子具有重要意义。在 TNF-α 诱导的小鼠 BMMs 向破骨细胞分化过程中，微阵列筛选出 miR-378，miR-21，miR-29b，miR-146a，miR-155，miR-210高表达，miR-223 低表达[39]。转录因子RBP-J 是被证实的在 TNF-α 诱导的破骨细胞分化和骨吸收过程中发挥关键作用[40]。Miller[41]发现miR-182 通过抑制 Foxo3 和 Maml1 而促进 TNF-α诱导的破骨细胞生成，并且RBP-J可通过抑制miR-182 的生成，进而抑制 TNF-α 诱导的破骨细胞生成。