组织工程皮肤的血管化策略和未来方向

黄声震，吕长胜

（中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院，北京，100144）

我国每年出现不同类型皮肤缺损的患者高达数千万[1]，包括严重烧伤、软组织坏死、肿瘤切除术等引起的广泛全层皮肤缺损，而临床上自体皮肤移植供区有限，所以替代人工皮肤的需求很大。

皮肤是人体面积最大的器官，占总体重的16%并且具有1.8微米的平均表面积[2]，正常皮肤分三层：表皮层主要为角质形成细胞，相对较薄（10-100微米），起屏障的功能；真皮层较表皮厚（400-2000 微米），其中成纤维细胞通过分泌细胞外基质提供皮肤机械强度，血管运输营养、生物活性物质、免疫细胞、排泄代谢废物等；皮下组织主要是脂肪，起支持表皮和真皮、隔热、机械保护的作用[3]。组织工程皮肤三个要素被认为是：支架材料、种子细胞、血管形成。随着各个学科的发展，很多开发新血管化策略的研究取得了快速进展。这些策略可以分为血管生成和预血管化的方法[4]。

1 血管化策略机制

新血管形成包括两种的机制：血管发生（Vasculogenesis)、血管新生(Angiogenesis）。内皮前体细胞或成血管细胞分化为内皮细胞来形成原始血管网络被称为血管发生，主要在胚胎发育时形成血管系统[5]。血管新生是指从原来的血管中生长出新的毛细血管，主要负责血管网络的重塑和扩展，包括两种不同的机制：内皮发芽和肠套叠微血管生长（IMG）[6]。内皮发芽过程包括内皮细胞迁移、增殖和管状腔隙形成，IMG 通过组织折叠和组织间组织的插入到血管腔中来划分现有的血管腔。血管新生可能是由缺氧引起的，缺氧会上调许多基因的表达来参与血管形成，包括NO 合酶、VEGF 和血管生成素-2，血管受到NO的影响而扩张，并且受到VEGF 的作用而渗透性增加，主要是蛋白酶活化作用于基底膜和细胞外基质使其溶解，血浆蛋白质渗漏出来作为临时基质，然后内皮细胞在整联蛋白和基质之间的相互作用下迁移，并在血管内皮生长因子（VEGF）和其他分裂素作用下增殖，然后血管芽吻合形成血管环和网络[7]。在伤口愈合过程中，VEGF 出现强烈表达，其特征是微血管通透性和血管生成增加，机制是由角蛋白14 启动子驱动的皮肤中VEGF 的转基因过表达导致曲折的皮肤毛细血管密度增加[8]，所以VEGF 在血管生成过程的起重要作用，不仅启动血管形成，还启动一系列分子和细胞事件，最终生成成熟的血管网络。

血管新生在许多病理状态中被诱导，例如伤口愈合、慢性炎症，组织工程皮肤中血管化通常被认为是通过正常血管新生过程实现的，主要通过内皮发芽实现。而血管生成机制的研究进一步深入，能更好的引导组织工程皮肤血管化的策略方向。

2 支架层面的血管化策略

真皮支架模仿天然皮肤真皮层，其中含有致密的微血管网，滋养表皮角质形成细胞，同时它的细胞外基质（包括胶原纤维、弹性纤维等）维持生长，研究发现人工真皮的存在就可诱导VEGF 的表达，并促进血管内皮细胞的增殖和新血管的形成[9]，说明支架在组织工程血管化中起关键作用，同时支架材料及支架结构的孔隙率、孔隙大小、机械强度、生物降解等均能在不同程度影响血管化。

2.1 支架材料

水凝胶是最常见的生物支架材料，是天然亲水聚合物形成的三维（3D）网络，包括多糖（例如透明质酸、藻酸盐、壳聚糖和纤维素）、蛋白质（胶原蛋白、明胶）和DNA 等，类似于天然细胞外基质（ECM）。与Integra 支架相比，交联水凝胶的血管生成反应显著增强，水凝胶处理能够促使完整的皮肤再生[4]。胶原蛋白被证明可以促进生物材料的血管形成，促进人类毛细血管样网络的自发形成[10]。细菌纤维素本身具有伤口愈合和组织再生特性，改良的纳米复合材料能够形成健康的肉芽和丰富血管[11]。Carriel 等[12]使用纤维蛋白-琼脂糖生物支架开发全层人皮肤构建体，离体和体内水平评估表明支架在发育4 周后保持稳定，并且体内植入能够使真皮适当分化，并且植入后第10 天存在大量成纤维细胞和血管。

2.2 支架结构

2.2.1 孔径和互连性支架结构层面血管化主要由其孔径和互连性决定。支架的微结构比如孔径率和纤维排列，可以影响细胞的生长、迁移、增殖等，支架的三维结构允许细胞的黏附增殖、向内生长并为血管生长提供必要的空间，因此影响血管形成过程[13]，通常认为孔径率需大于70%。Choi,S.W 等[14]实验证明孔径＞200μm 的支架有利于形成低密度和深穿透的具有大血管的血管网络，而孔径＜200μm 的支架有利于形成较高密度和较低穿透深度的较小血管，可用于构建不同大小的组织。虽然孔径对血管形成具有较大影响，孔隙互连对于生物材料支架同样关键，不完全的孔隙相互连接可能限制血管长入，Xiao X 等[15]通过激活PI3K/Akt 途径，研究三维多孔β-磷酸三钙支架互连大小诱导血管新生的不同作用，证明具有150mm互连尺寸的支架显着增强了Akt和eNOS磷酸化，刺激NO 产生，不仅增强内皮细胞增殖、改善内皮细胞功能，还通过促进细胞粘附和迁移，增强血小板-内皮细胞粘附分子和血管内皮生长因子的表达。

2.2.2 支架加工技术常用的支架加工技术包括常用的冷冻干燥、盐浸和传统静电纺丝技术，但易形成薄片状纳米纤维，形成小而不规则的孔结构[16]。静电纺丝技术是允许微米或纳米尺度的连接纤维的技术，电纺支架的松散结合和多孔性质有利于细胞迁移和整个支架中的均匀分布[17]。不同结构的电纺纳米纤维通过重塑细胞骨架和细胞核来影响细胞行为，对齐的纳米纤维的结构信号通过旁分泌效应和间隙连接激活刺激细胞-细胞通讯[18]。

生物打印是一种经济可行且可重复的创建空间组织的方法，能够模仿健康天然的皮肤组织[19]。由于其使细胞和基于细胞的材料可以以精细的空间排列分配以模仿天然组织而成为吸引人的生物加工平台，通过构建具有预定结构的载有细胞的支架，来实现微环境的再现[20]。Kim 等[21]将皮肤衍生的细胞外基质首次配制成可印刷材料并保留了皮肤的主要ECM 组合物以及有利的生长因子和细胞因子，用于印刷全厚度3D 人体皮肤模型，并进一步使用这种bioink 印刷3D预血管皮肤片。

2.3 物理/化学修饰支架

支架材料的物理化学性质显著影响其血管形成，目前生物材料的生物活性已被广泛关注，最广泛报道的生物玻璃（BG）（主要是离子产品）的化学信号能够促进成纤维细胞的基质合成和内皮细胞的分化及血管生成，在伤口愈合的早期阶段，由BG 激活的成纤维细胞可以迁移到伤口部位，合成细胞外基质作为新形成血管的床[18]，并刺激成纤维细胞表达一些关键细胞因子和重要蛋白质[22]。Xu Y等[18]发现BG离子产物和定向纳米纤维可以协同上调血管生成生长因子和细胞外基质蛋白的表达，它的化学信号主要通过增强旁分泌效应刺激细胞-细胞通讯，刺激内皮细胞和成纤维细胞中基质蛋白中血管生成生长因子的表达上调，分泌的血管生长因子进一步诱导内皮细胞迁移到伤口部位。不同刺激信号和关键细胞共培养物的组合可能是组织工程的有前景和有效的方法。近年认为等离子处理表面活化是能够改善血管生成的有潜力的技术，Ring,A 等人[10]将低压氩/氢等离子体处理的胶原蛋白-弹性蛋白基质支架移植到小鼠背部皮肤折叠室中，与未处理的对照相比，这种表面活化增强了血管生成并加速了修饰的胶原-弹性蛋白基质的新生血管形成。Wang X 等[23]制备了聚（L-丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）针织网与胶原-壳聚糖支架（CCS）整合以获得混合支架，PLGAm/ CCS 中的胶原蛋白-海绵仍保持多孔，相互连接并占据PLGA 网孔，相较仅由胶原-壳聚糖组成的支架，提高了机械强度。

2.4 光合支架

移植组织工程皮肤后血管形成时间较长，而氧的扩散有限，溶解度低，消耗率高，对于较厚移植皮肤中心细胞可能会出现缺氧。移植皮肤内产生的氧梯度与细胞的增殖直接相关，也影响基因表达和基质沉积等。Hopfner 等人[24]通过名为HULK（来自德国Hyperoxie Unter Licht Konditionierung 的缩写）的方法将单细胞和光合微藻接种到支架中培养用于组织修复，这种微藻显示出高生物相容性和光合作用，将支架暴露于光照能够触发光合作用并且实现原位氧产生并且产生足够的氧气。

除了氧气之外，对这种光合支架进行基因工程以提供其他关键分子，比如Myra Noem 等[25]将载有表达血管生成重组蛋白VEGF 基因的微藻接种于支架，证实除了氧之外，光合支架能够释放重组生长因子，进一步促进组织再生。

2.5 生物激活因子

VEGF 是血管生成过程中的关键介质，是内皮细胞的有效促分裂原，并能够通过上调几种内皮整合素受体诱导内皮细胞迁移和发芽，移植单独的VEGF 会诱导不稳定的血管结构（渗漏血管）；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）通过对内皮细胞的直接作用和间接作用上调内皮细胞的VEGF 来促进血管生成，这两个因子的协同作用通过募集平滑肌肌动蛋白阳性细胞来稳定血管壁，血小板衍生生长因子通过募集周细胞和分化未成熟的内皮细胞来促进血管生成[26]。所以持续传递各种活性因子至真皮支架能够促进血管化作用,目前已成为一种广泛的血管化策略。由于蛋白稳定性和免疫活性的限制，这些活性因子的可持续释放是很重要的，Li W 等[27]用明胶微球的方式作为长期释放和随后的血管生成加强的平台，得到了有意义的结果。

3 基于细胞的血管化策略

在皮肤组织工程中增加血管生成的一个重要方法是将细胞接种到支架上，包括内皮细胞及其祖细胞、成纤维细胞、各类干细胞等，其中内皮细胞是组成血管结构的主要细胞，在血管化方面起着关键作用，但是移植细胞需要满足以下条件：易于获得及培养扩增，存活率高，无或较低的免疫原性，不会导致癌变等。

3.1 内皮细胞

内皮细胞来源有丢弃的包皮、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）等，但成熟的内皮细胞在临床条件下不容易大量收获并且在培养期间表现出低复制率，在3D培养中迅速凋亡[28]，而当种子HUVEC 经逆转录病毒转导以组成型表达抗凋亡蛋白Bcl-2 时，血管化浓度和成功植入的频率进一步增加，这种操作增加了HUVEC 形成成熟血管的能力，且Bcl-2 转导使HUVEC对一些形式的免疫介导的损伤具有抗性[29]。

内皮细胞的前体细胞：内皮祖细胞，存在于骨髓及血液中，可以诱导成血管内皮细胞，参与缺血组织的血管重建和血管的内膜化[30]。可以从血液中非侵入性分离，具有高克隆性潜力。Dai NT 等[31]将人内皮祖细胞和成纤维细胞的混合物接种到人血浆/氯化钙形成的凝胶支架中，结果显示预血管化的凝胶支架在手术后显着加速伤口愈合，组织学分析显示伤口区域的表皮和真皮的血管形成。

一些活性分子能够刺激增加内皮细胞量，蔡第心[32]使用EPO 动员EPCs，发现外周血EPCs 含量更多。研究发现基质细胞衍生因子-1α 能够与EPC 表面的特异性受体CXCR4(chemokine CXC receptor type4,CXCR4)结合并趋化EPC，在短时间内动员骨髓中EPC 进入外周血，并介导外周血中的EPC 迁移、归巢到缺血缺氧组织局部，促进血管新生及损伤血管的再内皮化，利用过表达SDF-1α 基因的方法，有学者构建了一种自动捕获内皮祖细胞的新方法来促进皮肤替代物血管化，为促进组织工程皮肤快速血管化提供了新思路[33]。

微环境能在一定程度上影响血管形成，极低频电磁场处理可以促进人工皮肤快速形成血管结构,而且促进新血管受体的血管结构相吻合[34]。

3.2 成纤维细胞

纤维蛋白是细胞生长和增殖的良好三维支持，促进细胞在三维框架内的粘附和渗透，促进细胞在三维框架内的粘附和渗透，并促进细胞在毛细血管样结构中的附着。成纤维细胞是参与伤口愈合的重要细胞，能够分泌到一系列蛋白到三维支架的间隙中，已知这些细胞外基质分子的存在对于内皮细胞存活及其组织成微毛细管具有极其重要的作用[35]。胰岛素通过多种不同的信号途径诱导VEGF-mRNA 的表达来促进血管内皮细胞的增值，同时能促成成纤维细胞的生长及胶原合成，牛震海等[36]通过给133 只大鼠注射不同浓度胰岛素,发现小剂量胰岛素能有效的促进局部成纤维细胞的增殖并浸润真皮基质。

3.3 干细胞

干细胞经过非对称性复制分化成多种组织类型,能构建复杂组织结构，目前较理想的来源为间充质干细胞，其中脂肪源性间充质干细胞增殖和分化能力最佳,其次是来源于骨髓和软骨的间充质干细胞[37]。脂肪源性干细胞具有来源丰富,低免疫原性,几乎不表达MHC I 类抗原，低表达MHC II 类抗原，还具有免疫抑制特性[38]，并且体外扩增方便，分泌多种生长因子,也能通过旁分泌作用于成纤维细胞并分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,促进表皮细胞再生,促进创面愈合及组织血管化[37]，被认为是再生医学的主要候选者。Meruane MA 等[38]通过成年大鼠的腹股沟区域分离脂肪来源的干细胞接种至皮肤替代物48 小时，然后植入同一只大鼠，数据表明血管分布的增加和胶原的合成。

诱导多能干细胞（iPSC）具有巨大的潜力，Lin W 等[39]建立人类iPSCs 作为皮肤组织工程的潜在细胞来源，通过诱导具有碱性成纤维细胞生长因子的iPSC 衍生的间充质干细胞（iPSC-MSC）来获得具有血管生成和角蛋白原分化潜能的表皮样细胞系（bFGF）或角质形成细胞生长因子（KGF），这种具有血管生成和角质形成分化潜能的细胞系为构建良好血管化和角质化的组织工程皮肤提供了有希望的新细胞来源。

皮肤中的毛囊干细胞、毛乳头细胞等也是有希望的细胞来源，通过明胶-软骨素-6-硫酸盐-透明质酸支架接种血管内皮生长因子165 修饰的毛囊干细胞能促进皮肤替代物中的血管形成[40]。刘坡等[41]用同种异体脱细胞真皮基质为支架,并在真皮乳头侧种植毛乳头细胞的方法，证实毛乳头细胞可促进移植皮肤替代物血管形成,能够增加组织工程皮肤存活率。

4 基因层面

4.1 MicroRNAs

MicroRNAs 是小的非编码RNA 片段（19-24 个核苷酸），通过增强信使RNA 的降解、阻碍mRNA 的翻译等来影响基因的表达并控制细胞的行为，进而改变皮肤的生物活性环境；因为它的体积小、半衰期长，所以MicroRNA 能够持续、精确的并且可控的调节细胞行为，在组织工程皮肤领域，主要是通过调节内皮细胞的迁移、增生、形态等，在促进血管形成方面起到重要作用[3]，目前认为促血管生成miR 是miR-126和miR-132，但临床血管生成控制仍在研究中[42]。Devalliere J 等[43]使用靶向纳米粒子将miR-132 转染内皮细胞，与移植脂质到免疫缺陷小鼠相比，实验组能使每平方毫米的微血管数量增加2 倍以上。

4.2 基因转染

近年来，基因工程发展迅速，以转导生物活性因子基因为主，张向荣等[44]用脂质体介导hVEGF165 基因的方式转染人骨髓间充质干细胞,结果显示该种人工皮肤较对照组有效促进组织工程皮肤的早期血管化及改善创面愈合。Xie WG 等[45]用VEGF 腺病毒载体转染人成纤维细胞，然后将遗传修饰的成纤维细胞接种在Integra 人造皮肤上，24 小时后Integra 贴片被移植到裸鼠的全层皮肤缺损上，结果显示实验组血运重建条件明显优于对照组。Lord MS 等[46]通过冷冻干燥制备壳聚糖支架，并装载编码perlecan 结构域I和VEGF189 的质粒DNA，观察大鼠伤口愈合表明该支架具有诱导血管生成和伤口愈合的潜力。郭瑞等[47]将压缩DNA 形成纳米复合粒子，再通过物理吸附的方法负载到胶原-壳聚糖支架上,缓释出来的TMC/DNA微粒中的DNA 由于其超螺旋结构而具有较高的细胞转染能力，相较对照组，新生血管数和成熟血管数都得到明高提高。

5 细胞膜片技术

细胞膜片技术是指细胞在体外连续培养形成由细胞和细胞外基质组成的复层生长的膜片，其中细胞自分泌丰富的细胞外基质作为内源性支架，保持完整的细胞-细胞连接和细胞外基质[37]。Hasegawa A 等[48]用细胞片技术和离心技术开发了一种快速细胞片-组织制造系统，能保持细胞活力和组织的细胞因子生产能力，且不会出现细胞损伤，这一新系统将成为基于细胞片的组织工程和再生医学领域的强大工具，并加速细胞片在临床应用中的应用。

6 展 望

过去几十年的组织工程皮肤领域的快速发展，已经有了显著的成果，随着研究的深入，相信能够快速血管化的组织工程皮肤能够在不久的将来生产出来。这不仅能够解决皮源短缺的问题，同时，组织工程皮肤有助于药物的筛选、配方开发、化学和化妆品测试以及基础研究等。除此之外，随着现代科学技术的发展，运用目前快速发展的科技与组织工程皮肤结合的研究也在进行中（比如电子传感器、表皮电子等）[2]。相信这些会是未来的发展方向。